[發(fā)明專利]一種利用GEM純化包涵體的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810897135.0
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109180818A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周志江;趙芳坤;杜仁鵬;韓燁;肖華志;宋巧智;曹碩
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/14;C12N15/70
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 琪琛

1.一種利用GEM純化包涵體的方法，其特征在于所描述方法步驟如下：

1)構(gòu)建重組蛋白-AcmA融合表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21；

2)利用IPTG進行誘導(dǎo)表達；

3)制備GEM；

4)誘導(dǎo)表達產(chǎn)物破碎后，上清與GEM混勻結(jié)合，離心分離；

5)8M尿素溶解包涵體；

6)GEM從尿素溶解的包涵體中純化分離重組蛋白；

7)包涵體的復(fù)性；

8)酶活測定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用GEM純化包涵體的方法，其特征在于步驟1)以乳酸乳球菌NZ9000基因組為模板，擴增得到AcmA錨定區(qū)片段，連接到pET28a上得到錨定質(zhì)粒pET28a-AcmA，以解淀粉芽孢桿菌BH072基因組為模板，擴增得到α-淀粉酶的基因片段，連接到質(zhì)粒pET28a-AcmA上，得到重組表達質(zhì)粒pET28a-α-amylase-AcmA，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達載體BL21。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用GEM純化包涵體的方法，其特征在于步驟2)指劃線分離得到帶有質(zhì)粒的BL21的單克隆，過夜培養(yǎng)得到種子液，以1％-5％的接種量接種，當(dāng)菌液OD₆₀₀達到0.6-0.9時加入IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)濃度為0.5mM-2mM，誘導(dǎo)溫度選擇為37℃，誘導(dǎo)時間為18小時-24小時，所有培養(yǎng)基為添加50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用GEM純化包涵體的方法，其特征在于步驟3)指利用含1％葡萄糖的M17培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸乳球菌NZ9000至OD₆₀₀在2.0-2.5之間，4000rpm離心收集菌體，利用PBS洗滌去除培養(yǎng)基，將菌體重懸于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸30-60分鐘，8000rpm離心收集沉淀，利用PBS充分洗滌，得到GEM。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用GEM純化包涵體的方法，其特征在于步驟4)指4000rpm離心收集誘導(dǎo)后的菌體，利用預(yù)冷的PBS洗滌去除培養(yǎng)基，將菌體重懸于預(yù)冷的PBS中，超聲破碎細胞，2秒超聲破碎，4秒停頓，超聲時間為20分鐘，8000rmp離心20分鐘分離，取沉淀。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用GEM純化包涵體的方法，其特征在于步驟5)指將得到的包涵體沉淀利用8M尿素充分溶解，12000rmp離心，取上清即為尿素溶解包涵體溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用GEM純化包涵體的方法，其特征在于步驟6)指將步驟5得到的尿素溶解包涵體溶液與GEM混勻，室溫下攪拌結(jié)合20-50分鐘，12000rpm離心分離，取沉淀，利用PBS充分清洗以去除非特異性結(jié)合和尿素。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用GEM純化包涵體的方法，其特征在于步驟7)指將結(jié)合有重組蛋白的GEM重懸與PBS中，4℃過夜復(fù)性。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用GEM純化包涵體的方法，其特征在于步驟8)指利用DNS法測定重組蛋白的酶活。