[發明專利]基于熒光定量PCR的茶樹基因CsTTG1表達特征分析方法

在審

• 申請號: 201810896179.1
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN108950048A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 孫彬妹;代風玲;劉任堅;劉少群;肖熙
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 廣州市時代知識產權代理事務所(普通合伙) 44438
• 代理人: 盧浩

1.基于熒光定量PCR的茶樹基因CsTTG1表達特征分析方法，其特征在于，包含以下步驟：

S1.獲取待測基因組RNA；

S2.將RNA反轉錄為cDNA；

S3.以反轉錄產物cDNA為模板，以Acting基因作為內參，通過PCR擴增引物進行PCR擴增；S4.對PCR擴增的產物進行測序檢測分析。

2.根據權利要求1所述的基于熒光定量PCR的茶樹基因CsTTG1表達特征分析方法，其特征在于，所述待測基因組為CsTTG1基因組。

3.根據權利要求1所述的基于熒光定量PCR的茶樹基因CsTTG1表達特征分析方法，其特征在于，所述待測基因組為CsTTG1基因組，所述PCR擴增引物其上游引物和下游引物的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

4.根據權利要求1所述的基于熒光定量PCR的茶樹基因CsTTG1表達特征分析方法，其特征在于，所述待測基因組為CsTTG1基因組，所述CsTTG1的內參基因Acting引物其上游引物和下游引物的序列分別如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

5.根據權利要求1所述的基于熒光定量PCR的茶樹基因CsTTG1表達特征分析方法，其特征在于，所述待測基因組為CsTTG1基因組，步驟S2中，所述RNA序列分別反轉錄成cDNA的方法，包含以下步驟：

（1）基因組DNA去除，在RNase free 的離心管中配置如下混合液4 x gDNA wipe Mix1-4ul；模板RNA 1-4ul；RNase free ddH₂O 2-7ul；用移液槍輕輕吹打混勻，放于水浴鍋中水浴38-50℃ 1-4min；

（2）配置逆反轉錄反應體系，在以上體系中加入5x HiScript ║ qRT SuperMix║ 1-4ul，用移液槍輕輕吹打混勻；

（3）進行逆轉錄反應，15-30℃ 7-15min，40-60℃ 22-42min，72-90℃ 3-8min。

6.根據權利要求5所述的基于熒光定量PCR的茶樹基因CsTTG1表達特征分析方法，其特征在于，所述待測基因組為CsTTG1基因組，步驟S2中，所述RNA序列分別反轉錄成cDNA的方法，包含以下步驟：

（1）基因組DNA去除，在RNase free 的離心管中配置如下混合液4 x gDNA wipe Mix2ul；模板RNA 2ul；RNase free ddH₂O 4ul；用移液槍輕輕吹打混勻，放于水浴鍋中水浴42℃ 2min；

（2）配置逆反轉錄反應體系，在以上體系中加入5x HiScript ║ qRT SuperMix║ 2ul，用移液槍輕輕吹打混勻；

（3）進行逆轉錄反應，25℃ 10min，50℃ 30min，85℃ 5min。

7.根據權利要求1所述的基于熒光定量PCR的茶樹基因CsTTG1表達特征分析方法，其特征在于，步驟S3中，所述PCR擴增的方法包括以反轉錄產物為模板、以Acting基因作為內參、通過PCR擴增引物進行qRT-PCR反應，每一個反應分別設3次重復，反應體系如下：

（1）2×SYBR Green Mix：3-9μL；

（2）cDNA模板：0.2-1.6μL；

（3）引物各0.025-0.205μL；

（4）加水至總體積達到8-12μL；

（5）PCR反應程序：88-96℃ 8-13 min；88-96℃ 6-15s，48-68℃ 12-20s，62-83℃ 20-50s，40個循環。