[發明專利]一種檢測EGFR基因突變的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201810896141.4
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN108949990B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 蔣析文;劉悅;朱小亞;顏爾聰
• 申請（專利權）人: 廣州達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 上海助之鑫知識產權代理有限公司 31328
• 代理人: 陳詳

1.一種用于數字PCR檢測EGFR基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括用于檢測EGFR基因20外顯子C797S位點突變的第一引物對、第一探針組，所述第一引物對為SEQ IDNO.:16所示的上游引物和SEQ ID NO.:17所示的下游引物，所述第一探針組為SEQ ID NO.:18所示的第一突變探針、SEQ ID NO.:19所示的第二突變探針和SEQ ID NO.:20所示的野生探針；

所述試劑盒還包括用于檢測EGFR基因20外顯子T790M位點突變的第二引物對、第二探針組，所述第二引物對為SEQ ID NO.:8所示的上游引物和SEQ ID NO.:9所示的下游引物，所述第二探針組為SEQ ID NO.:10所示的突變探針和SEQ ID NO.:11所示的野生探針；

所述試劑盒還包括用于檢測EGFR基因19外顯子19del位點的第三引物對、第五引物對、第三探針組和PCR擴增阻斷劑，所述第三引物對為SEQ ID NO.:1所示的上游引物和SEQ IDNO.:2所示的下游引物，所述第五引物對為SEQ ID NO.:5所示的上游引物和SEQ ID NO.:6所示的下游引物，所述第三探針組為SEQ ID NO.:4所示的突變探針和SEQ ID NO.:7所示的內控探針，所述PCR擴增阻斷劑為SEQ ID NO.:3所示；

所述試劑盒還包括用于檢測EGFR基因21外顯子L858R位點的第四引物對、第四探針組，所述第四引物對為SEQ ID NO.:12所示的上游引物和SEQ ID NO.:13所示的下游引物，所述第四探針組為SEQ ID NO.:14所示的突變探針和SEQ ID NO.:15所示的野生探針。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括第一容器，所述第一容器內包含所述第一引物對和所述第一探針組；

所述試劑盒還包括第二容器，所述第二容器內包含所述第二引物對和所述第二探針組；

所述試劑盒還包括第三容器，所述第三容器內包含所述第三引物對、所述第五引物對、所述第三探針組和所述PCR擴增阻斷劑；

所述試劑盒還包括第四容器，所述第四容器內包含所述第四引物對和所述第四探針組。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照，和/或陰性對照。

4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括數字PCR反應酶；和/或數字PCR用緩沖液。

5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，各上游引物和各下游引物在反應體系中的最終濃度為0.1～10μmol/L。

6.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，各突變探針在反應體系中的終濃度和各野生探針在反應體系中的終濃度比為2：1。

7.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，各突變探針在反應體系中的終濃度為0.1～5μmol/L。

8.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，各野生探針在反應體系中的終濃度為0.05～2μmol/L。

9.一種非診斷目的的數字PCR檢測EGFR基因突變的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

（1）提供待檢測對象的DNA樣本；

（2）制備數字PCR反應體系并進行數字PCR檢測：

其中，所述數字PCR反應體系包括第一數字PCR反應體系，所述第一數字PCR反應體系包括步驟（1）提供的所述DNA樣本、第一引物對和第一探針組；

所述數字PCR反應體系還包括第二數字PCR反應體系，所述第二數字PCR反應體系包括步驟（1）提供的所述DNA樣本、第二引物對和第二探針組；

所述數字PCR反應體系還包括第三數字PCR反應體系，所述第三數字PCR反應體系包括步驟（1）提供的所述DNA樣本、第三引物對、第五引物對、第三探針組和PCR擴增阻斷劑；

所述數字PCR反應體系還包括第四數字PCR反應體系，所述第四數字PCR反應體系包括步驟（1）提供的所述DNA樣本、第四引物對和第四探針組；

其中，所述第一引物對為SEQ ID NO.:16所示的上游引物和SEQ ID NO.:17所示的下游引物；所述第二引物對為SEQ ID NO.:8所示的上游引物和SEQ ID NO.:9所示的下游引物；所述第三引物對為SEQ ID NO.:1所示的上游引物和SEQ ID NO.:2所示的下游引物；所述第四引物對為SEQ ID NO.:12所示的上游引物和SEQ ID NO.:13所示的下游引物；所述第五引物對為SEQ ID NO.:5所示的上游引物和SEQ ID NO.:6所示的下游引物；

所述第一探針組為SEQ ID NO.:18所示的第一突變探針、SEQ ID NO.:19所示的第二突變探針和SEQ ID NO.:20所示的野生探針；所述第二探針組為SEQ ID NO.:10所示的突變探針和 SEQ ID NO.:11所示的野生探針；所述第三探針組為SEQ ID NO.:4所示的突變探針和SEQ ID NO.:7所示的野生探針；所述第四探針組為SEQ ID NO.:14所示的突變探針和SEQID NO.:15所示的野生探針；所述PCR擴增阻斷劑為SEQ ID NO.:3所示。