[發明專利]一種檢測EGFR基因突變的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201810896141.4
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN108949990B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 蔣析文;劉悅;朱小亞;顏爾聰
• 申請（專利權）人: 廣州達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 上海助之鑫知識產權代理有限公司 31328
• 代理人: 陳詳

本發明提供了一種檢測EGFR基因突變的試劑盒及方法，具體的地，本發明公開了一種檢測EGFR基因突變的方法、引物、探針及包括該引物探針混合液的試劑盒，提供了檢測C797S位點突變的引物及探針，檢測T790M位點突變的引物及探針，檢測19del位點突變的引物及探針，檢測L858R位點突變的引物及探針。使用本申請的方法，基于數字PCR平臺能檢出0.1％的突變率，具有優化過程簡單、可檢突變類型多、絕對定量、靈敏度高、樣本易獲取等優點。

技術領域

本發明屬于生物技術和腫瘤診斷領域，具體地說，本發明涉及檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變的試劑盒及方法。

背景技術

肺癌的發病率和死亡率均居世界首位，其中，非小細胞肺癌(NSCLC)占85％以上，而大部分患者在確診時已處于癌癥晚期，其死亡率高達80％-90％。因此，晚期NSCLC的治療越來越受到人們重視。含鉑雙藥聯合化療仍是晚期NSCLC治療的主要手段，但治療效果并不十分理想。隨著腫瘤分子生物學技術的發展，藥物靶向治療效果較為顯著，相對傳統細胞毒性藥物，靶向治療可以更加精準地作用于腫瘤部位，能明顯減少對周圍正常組織的損傷，在降低患者不良反應發生率的同時，提高作用于腫瘤的準確性。

表皮生長因子受體(EGFR)是一種跨膜蛋白，廣泛分布于細胞膜上，為受體酪氨酸激酶家族成員之一。EGFR與表皮生長因子(EGF)的結合可啟動細胞核內相關基因，從而促進細胞分裂增殖。EGFR存在于大多數細胞中，對腫瘤細胞的生長、繁殖、轉移、新血管生成、浸潤等起到重要作用，在非小細胞肺癌、結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤中均有表達。

近年來，以EGFR為靶點的分子靶向治療對晚期NSCLC患者的效果較好。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)是EGFR突變型晚期NSCLC的重要治療手段之一，在客觀緩解率和無進展生存期方面均顯著優于傳統含鉑雙藥聯合方案，但大部分患者在治療6-12個月后即出現EGFR-TKIs耐藥，其耐藥機制主要包括原發性耐藥和獲得性耐藥。在NSCLC患者中，EGFR突變通常發生在18-21號外顯子，其中第19外顯子19del位點缺失以及第21外顯子L858R位點突變是最常見的EGFR敏感突變，約占總突變的90％，又叫經典突變或熱點突變。第20外顯子的T790M突變是EGFR-TKI最常見的獲得性耐藥突變，應用EGFR-TKIs治療NSCLC出現獲得性耐藥的患者中約50％可檢測到T790M突變。最近，EGFR20外顯子C797S突變被定義為第三代TKI的耐藥突變。對于第三代TKI耐藥的NSCLC患者的治療來講，用一種高靈敏度的方法來確定C797S位點的突變有助于病情提早發現。研究結果證實，在中國NSCLC患者中，EGFR總突變率約為30％，其中腺癌患者突變率約為50％，女性非腺癌患者可高達60％-70％。

目前，組織活檢是腫瘤檢測的金標準，但由于組織樣本的獲取存在有創性和局限性，大多數晚期NSCLC患者或復診患者很難利用重復組織活檢來監測機體耐藥情況及實時病情，這就使得液體活檢技術應運而生。液體活檢主要以血液游離核酸(cfDNA)為檢測對象，具有更全面地反映腫瘤特性、克服腫瘤異質性難題及非侵入性可多次取樣等優點。大量研究表明，cfDNA可作為組織不可取時的首選替代標本，用于評估EGFR基因突變狀態，選擇是否采用EGFR-TKI治療方法。cfDNA檢測僅需少量外周血樣本，操作簡單、無創、具有可重復性，適合用于對NSCLC患者病情進展連續監測，腫瘤預后評估，殘余病灶檢測等。由于cfDNA在晚期肺癌患者血液中的濃度極低，因此，其對檢測靈敏度要求較高，常用的基因突變檢測方法如：Sanger測序法、高分辨熔點曲線分析法、實時熒光定量PCR法、變性高效液相色譜技術等均難以滿足其檢測要求。

因此，本領域迫切需要開發能夠有效檢測肺癌患者血液中cfDNA的技術以滿足臨床需求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測EGFR基因突變的試劑盒及方法。