[發明專利]檢測雞肉中恩諾沙星的銀納米粒子消光免疫層析試紙條

在審

• 申請號: 201810895939.7
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN108957009A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 熊勇華;江湖;郭亮;李響敏;賴衛華;聶麗娟
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬分析檢測領域，公開了檢測小分子物質的免疫層析試紙條：將修飾牛血清白蛋白的熒光物質分別與檢測抗原以及抗免疫球蛋白G抗體混合，噴涂在試紙條特定區域上做為檢測線及質控線，標記特異性單克隆抗體的銀納米粒子(銀消光探針)噴涂在試紙條結合墊。當樣品溶液不存在待測物時，銀消光探針與檢測線上檢測抗原結合，吸收了熒光物質的激發光或發射光而使檢測線無熒光，而質控線有熒光；當樣品溶液存在待測物時，銀消光探針優先與待測物結合，此時結合在檢測線上的銀消光探針數量減少，而結合在質控線上的銀消光探針數量增加，導致試紙條檢測線熒光增加，而質控線熒光下降。本發明較傳統免疫層析試紙條檢測小分子物質的消線判讀模式更靈敏。

技術領域

本發明屬于免疫學分析檢測技術領域，涉及檢測雞肉中恩諾沙星的銀納米粒子消光免疫層析試紙條。

背景技術

免疫層析技術具有速度快、抗基質干擾能力強、操作簡便等優點，是現場快速篩查的首選方法，也是食品安全、醫藥衛生、環境保護等領域創新研究的熱點。近年來，基于免疫層析技術的膠體金試紙條得到了廣泛應用，然而傳統的膠體金免疫層析方法因檢測靈敏度不高，在檢測某些微量或痕量分析物如食品中污染的真菌毒素等方面仍存在較大缺陷。因此，提高免疫層析方法的檢測靈敏度對于拓延其適用范圍具有非常重要的意義。熒光標記物與傳統膠體金標記物相比，具有更高的信號強度，可提高試紙條檢測靈敏度。

利用試紙條檢測小分子待測物，通常使用競爭反應模式，即檢測線上的人工抗原與待測物共同競爭熒光物質標記的抗體，檢測信號強度與待測物含量成反比關系，當待測物含量處于較低水平時，較強的檢測信號對待測物含量的微小變化并不敏感，因此靈敏度偏低。在競爭免疫層析試紙條上構建熒光消減模式可以使待檢物濃度與熒光強度成正比，即待檢物在痕量存在時熒光信號從無到有，可以提高檢測靈敏度和準確性。相較于常規膠體金粒子，銀納米粒子具有更高的摩爾消光能力，因此具有更強的熒光消減能力，從而可進一步提高試紙條檢測靈敏度。此外，銀納米粒子的消光光譜隨粒子粒徑增加而增大，銀納米粒子粒徑從10nm到100nm，對應的表面等離激元共振(SPR)吸收峰從400nm到500nm，拓寬了膠體金熒光“淬滅”免疫層析試紙條熒光物質的選擇范圍(金納米粒子SPR吸收峰在500nm以上)。

發明內容

本發明的銀納米粒子消光免疫層析試紙條基于銀納米粒子吸收熒光物質的激發光或發射光而導致其熒光信號減弱，用于快速定性和定量檢測小分子物質。銀納米粒子消光免疫層析試紙條的結構組成見附圖1所示，包括濾紙、樣本墊、結合墊、NC膜和吸水紙等五部分組成，其中濾紙、樣本墊與結合墊層疊組裝在NC膜一端，吸水紙層疊在NC膜另一端，五部分整體固定在粘性卡紙上。熒光物質-BSA與待測小分子物質檢測抗原混合固定在試紙條檢測線，熒光物質-BSA與IgG Fc片段特異性識別抗體(二抗)混合固定在試紙條對照線(質控線)，銀納米粒子與小分子物質特異性抗體復合物(銀消光探針)固定在試紙條結合墊上，待檢物質溶液通過濾紙過濾，經樣本墊進入結合墊，待測小分子與銀消光探針結合，在吸水紙毛細作用下，待檢溶液在試紙條上流動，繼續前進到達檢測線，未與待測小分子結合的銀消光探針與檢測線上的檢測抗原結合，其余的銀消光探針繼續前進到達質控線與二抗結合。加樣十至二十分鐘后，試紙條在熒光讀取儀中讀取檢測線和質控線的熒光數值。由于銀納米粒子特異性的吸收熒光物質的激發光或發射光，導致檢測線上的熒光值與銀粒子數量成反比例，而與待檢小分子物質的濃度成正比例關系，樣品中不含待檢小分子物質時，檢測線上沒有熒光信號。本發明所述的一種檢測小分子物質的銀納米粒子消光免疫層析試紙條，制備方法為：

(1)熒光物質與牛血清白蛋白(簡稱BSA)通過羧基和氨基間共價鍵結合

所選用的熒光物質為熒光微球、量子點微球、量子點或熒光染料；熒光物質需先經過表面氨基或羧基修飾，再與BSA上的羧基或氨基通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(簡稱EDC)活化共價結合，得熒光物質-BSA；熒光物質的最適激發波長和最大發射波長二者至少其一在400nm至500nm之間；

(2)制備銀消光探針：