[發明專利]檢測雞肉中恩諾沙星的銀納米粒子消光免疫層析試紙條

在審

• 申請號: 201810895939.7
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN108957009A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 熊勇華;江湖;郭亮;李響敏;賴衛華;聶麗娟
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.檢測雞肉中恩諾沙星的銀納米粒子消光免疫層析試紙條，其特征在于制備方法如下：

待測物質為恩諾沙星，熒光物質為7-氨基-4-甲基香豆素-BSA，簡稱AMCA-BSA；

(1)銀消光探針合成：

1)銀納米粒子的合成包括種子生成及逐步生長，a)銀種子制備：在100mL體系中調整檸檬酸鈉SC濃度至5mM，單寧酸TA0.1mM，加熱劇烈攪拌，一開始沸騰，立即加入1mL25mMAgNO₃，溶液馬上變成亮黃色，補足體系體積至100mL，得到種子銀大小約15nm的種子銀溶液；b)銀粒子逐步生長：在100mL體系中移除19.5mL反應液，加入16.5mL水，溫度設定到90℃，加入0.5mL 25mM SC，1.5mL 2.5mM TA，1mL 25mMAgNO₃，補足體系體積至100mL，攪拌30min，重復移除19.5mL反應液，加入16.5mL水，0.5mL 25mM SC，1.5mL 2.5mM TA和1mL25mMAgNO₃，補足體系體積至100mL，90℃攪拌30min這一過程9次，獲得SPR吸收峰為442nm的銀納米粒子，與AMCA發射光一致；

2)銀納米粒子與抗恩諾沙星單克隆抗體結合：取1mL銀納米粒子溶液，7500轉離心10min，棄上清；沉淀重懸于1mL含沙恩諾沙星6.5μg的0.1M硼酸溶液，NaOH調pH至7.5；室溫攪拌2h，離心10min，棄上清；重懸于含0.1％(w/v)BSA的0.1M pH 7.5含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液中，5min后，7500轉離心10min，沉淀重懸于0.25mLpH 7.5含0.1％(w/v)BSA的0.1M硼酸溶液，4℃保存備用；

(2)合成恩諾沙星檢測抗原：

稱取1mg恩諾沙星、1mg NHS和1mg EDC，溶解于0.2mL DMF中，加入10μL三乙胺，室溫攪拌4h，逐滴加入2mL含10mg BSA的0.13M碳酸氫鈉溶液中，室溫緩慢攪拌過夜，轉入4℃0.01M，pH 7.4PBS中透析72h；

(3)銀納米粒子消光免疫層析試紙條的組裝：

試紙條包括濾紙、樣本墊、結合墊、NC膜和吸水紙五部分組成；其中，樣品墊用包含1％BSA，0.4％吐溫20和0.03％疊氮鈉的50mM pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液浸潤，室溫下減濕干燥10h；結合墊用包含0.2％吐溫20和2％蔗糖的0.01M pH 7.4的PBS緩沖溶液浸潤，室溫下減濕干燥12h，銀消光探針溶液稀釋5倍后以4μL/cm的濃度噴涂在結合墊上；將1.75mg/mL檢測抗原與60μg/mLAMCA-BSA混合后噴涂于NC膜的檢測線，0.25mg/mL驢抗鼠二抗與60μg/mLAMCA-BSA混合后噴涂于NC膜的質控線上，設置各線噴涂量均為0.75μL/cm，將噴涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6h；商業化的濾紙和吸水紙不經特殊處理，直接使用；濾紙、樣本墊與結合墊層疊組裝在NC膜一端，吸水紙層疊在NC膜另一端，五部分整體固定在粘性卡紙上；距離檢測線4.0mm至6.0mm處噴涂質控線；切割成寬度3.8mm每條，裝入試紙條卡盒中，卡盒與常規的膠體金速測卡盒相同，內有試紙條固定卡槽，在試紙條的濾紙位置留有加樣孔，在Nc膜上檢測線和質控線位置留有檢測窗口；試紙條檢測卡與干燥劑一起裝入避光袋密封保存待用。