[發明專利]基于illumina平臺的乳腺癌分型檢測試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201810895547.0
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109097467A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 張吉保;張明航;岳偉
• 申請（專利權）人: 江蘇蘇博生物醫學科技南京有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞;董建林

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于illumina平臺的乳腺癌分型檢測試劑盒及應用，該分型檢測試劑盒包括a）降解mRNA建庫試劑、引物及磁珠模塊；b）文庫定量試劑模塊；c）上機測序試劑模塊；所述的引物包括Bio?B?TVN引物、Primer?A隨機引物、Primer?A引物、Primer?B引物，磁珠為包被有鏈霉素的磁性珠粒，Bio?B?TVN引物上的生物素可與磁珠包被的鏈霉素相結合。本發明通過3’端測序的方式使得獲取的mRNA即便有部分降解亦可對樣本的整個轉錄組進行精確定量。通過傳統應用乳腺癌FFPE樣本表達譜分析的微陣列及個別基因表達定量的熒光定量手段不能實現十分精準的分析，而通過3’末端測序的方法可以達到精確定量的目的。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測FFPE樣本乳腺癌基因表達譜對乳腺癌進行分子分型的檢測試劑盒及應用。

背景技術

目前乳腺癌在臨床仍以患者年齡、原發瘤大小、臨床分期、組織學分級、腋窩淋巴結轉移和激素受體狀態等指標，預測乳腺癌預后和指導選擇治療方案。但乳腺癌個體差異性較顯著，上述標準無法進一步精確地預測預后，難以滿足乳腺癌治療方案“個體化”。比較分析乳腺正常組織和腫瘤的基因表達譜，可以明確mRNA水平的基因表達差異，從而根據基因表達情況預測患者的臨床轉歸，采取相應診療措施。基于基因表達譜的各種乳腺癌標簽表現出更加客觀、準確的預后預測能力，具有良好的發展前景。

自20世紀90年代中期基因芯片的出現，便被廣泛用于癌癥相關的基因表達譜分析，并用于預測人類癌癥中復雜多樣的生物學特征和臨床特征。雖然基因表達譜分析被廣泛應用于人類癌癥的研究中，但在患者的臨床治療方面的應用卻受到很大的局限。這是由于目前所獲得的大部分臨床病例腫瘤樣本都是通過甲醛固定或石蠟包埋的方式儲存，而很少通過低溫凍存的方式保存。為了嘗試利用這些豐富的腫瘤樣本，研究者嘗試通過RT-PCR或DASL等方式進行表達量的分析，但這些方法并不能夠進行精確的定量，且只能對少數的已知轉錄本進行定量。

近些年，隨著二代測序的出現以及測序成本的不斷下降，可以通過二代測序的方式分析FFPE樣本中mRNA的表達水平，從而克服微陣列技術對于FFPE樣本檢測的限制，并對功能基因組學產生革命性的影響。

傳統的mRNA測序技術是通過oligo dT反轉錄引物將mRNA反轉錄成cDNA，然后打斷建庫或是通過將帶有oligo dA尾的mRNA富集下來然后打斷、逆轉錄、建庫。這兩個方法都需要獲得高質量的RNA得以實現。

發明內容

有鑒于現有的關于乳腺癌的mRNA測序及定量手段主要是用新鮮組織進行的轉錄組測序，對于樣本有較高的要求，無法適應臨床診斷的需要。本發明的目的是提供一種不需要質量較好的mRNA，即便降解樣本也可以得到較優結果的基于illumina平臺的乳腺癌分型檢測試劑盒。

本發明的另一個目的是針對現有臨床診斷上的不足，提供了一種新的可用于乳腺癌分型的方法，通過高通量測序手段可以對乳腺癌患者的臨床FFPE樣本的mRNA進行的精確定量，從而通過對乳腺癌的表達譜分析癌癥患者所患腫瘤的病理進程，進而為臨床治療提供更加精確的癌癥分型手段及診療手段，同時也可為癌癥研究的專家及學者在乳腺癌表達譜上的研究提供更加廣泛的材料來源和分析數據。檢測方法具體步驟為：(a)通過切片機切下20μm厚度的切片3張，然后通過二甲苯和酒精脫蠟(b)Recover All total Nucleic Acid組織切片試劑盒提取總RNA(d)通過SuperscriptⅡ逆轉錄酶(invitrogne)和帶有生物素的、P5接頭及oligo dT的引物將mRNA逆轉錄成帶有接頭序列的cDNA，隨后合成cDNA的第二條鏈以及文庫構建。(e)通過Ampure XP磁珠純化二鏈合成產物。(f)通過帶有index的擴增引物對文庫進行擴增(g)擴增文庫上機測序(h)下機數據質量控制reads過濾、align、mapping和定量。