[發明專利]聯合免疫效果早期快速評價方法中的試劑及其應用

在審

• 申請號: 201810883430.0
• 申請日: 2018-08-06
• 公開（公告）號: CN109187121A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 施明;周春保;王福生
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三0二醫院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N15/14
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 高倩倩;崔雙雙

本發明公開了一種改良型溶血素，該溶血素由皂角苷、多聚甲醛、Triton X?100配制而成。在重癥ACLF患者中，本發明的改良型溶血素溶血后單核細胞的比例明顯高于BD Lysing^TM solution溶血的比例，表明本發明的改良型溶血素對單核細胞損傷要小于BD Lysing^TM solution，能夠獲得更高比例的單核細胞，更加有利于單核細胞的研究。

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，涉及聯合免疫效果早期快速評價方法中的試劑及其應用。

背景技術

流式細胞儀已應用于科學研究和醫學臨床檢驗的各個領域，如免疫功能的檢查，腫瘤抗原，轉移基因與抑癌基因及其他疾病相關基因的檢測，細胞凋亡，艾滋病診斷與預后判斷等。流式細胞術(flow cytometry，FCM)可以對處于快速直線流動狀態中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數、快速的定性、定量分析或分選的技術，是當代生命科學領域中先進技術之一，在基礎研究及臨床檢測等領域得到廣泛應用。

白細胞分群和計數是醫學診斷中分析人體血液的重要指標。血液中的白細胞有五種類型，淋巴細胞，單核細胞，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，后三種統稱為粒細胞，因此將白細胞分為三個亞群，即為淋巴細胞，單核細胞，粒細胞。

有效分離出比例高的單核細胞是聯合免疫效果早期快速評價方法中的重要環節。因為生物恐怖劑感染來勢兇險、病原復雜，基于單一免疫制劑的免疫方案往往不能發揮有效的防護作用，急需研發新的聯合免疫技術。為了應對生物恐怖劑和戰劑的威脅，美國在20世紀80年代生物防恐部門頒布了《聯合免疫條令》，重點發展包括聯合疫苗、廣譜藥物在內的聯合對抗措施。目前我國還沒有成熟的生物恐怖劑的聯合疫苗或聯合免疫方案。因為聯合免疫存在很多不確定性，各個成員間免疫應答是促進還是抑制，干擾程度如何，已經被感染后二重感染效率等都會影響聯合免疫的效果。此外，在需要應急聯合免疫的情況下，制定合理的聯合免疫方案后，如何快速、高通量評價聯合免疫的效果，是一個亟待解決的難題。現有的免疫效果評價標準包括中和抗體的水平以及細胞免疫反應尤其是CD8+T細胞(Tcytotoxic T cells，Tc)反應的強弱兩個方面。但從免疫到檢測抗體等的產生需要10天以上的時間，此檢測方法不利于應急聯合免疫情況下的效果評價，需要新的評價方法及技術在免疫初期即可判斷聯合免疫效果。本領域技術人員可知，天然免疫細胞中的巨噬細胞在病原微生物早期的吞噬、清除中發揮關鍵作用，巨噬細胞可分化為促進抗感染應答的M1型，以及抑制免疫應答的M2型。文獻報道及研究發現巨噬細胞表型與后期的細胞免疫應答能力相關，及M1表型導致強的抗感染免疫應答，而M2表型意味著低的抗感染細胞免疫應答，從而提示可以通過早期分析巨噬細胞表型快速判斷疫苗的聯合免疫效果。巨噬細胞是由單核細胞誘導而成，為了在體外研究是否可以通過研究巨噬細胞表型以實現快速判斷疫苗聯合免疫效果的目的，需要獲取大量的單核細胞，這就需要對血液中的白細胞進行高效分離。

溶血素是白細胞計數或白細胞分類的關鍵試劑，屬于臨床檢驗最常用的試劑之一，與稀釋液等配套用于血細胞分析儀(如流式細胞儀)中。白細胞分類計數需要稀釋血液樣本，并且需要特異的溶血素，一方面，溶血素使紅細胞(RBC)迅速溶解，溶解紅細胞后進行白細胞計數，以免干擾白細胞的檢測(因為血液中的紅細胞數量遠遠多于白細胞數量)。另一方面，為了保證白細胞三個亞群的檢測，白細胞的體積也需要一定程度的改變，此時的白細胞膜需要一定程度的溶解，以便釋放出胞漿，同時維持細胞核的完整狀態，保持一定體積以便進行分群測定。

在血樣品處理中，溶血素對外周血的細胞分群會產生明顯的影響，不同的溶血素對不同疾病的實驗結果有著顯著的影響。目前，流式細胞儀所用溶血素基本依靠進口，并且不能及時供應，給使用者帶來很大的不便和浪費。

發明內容