[發(fā)明專利]基于C2c2的腫瘤相關突變基因的gRNA、檢測方法、檢測試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810874299.1
• 申請日: 2018-07-25
• 公開（公告）號: CN109295055A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設計）人: 陳侃;羅鎮(zhèn)華
• 申請（專利權）人: 廣州普世利華科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N9/22;C12Q1/6827
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 張小黎

本發(fā)明提供了一種用于靶向腫瘤相關突變基因RNA的gRNA，本發(fā)明還提供了一種基于規(guī)律間隔成簇短回文重復序列(CRISPR)?C2c2系統的人腫瘤相關突變基因檢測方法、檢測試劑盒。本發(fā)明提供了檢測方法，綜合了gRNA靶向識別腫瘤相關突變基因轉錄產物RNA(靶標RNA序列)的優(yōu)勢以及當CRISPR?C2c2復合物檢測到靶標RNA序列時，復合物會切割帶有檢測標記的報告RNA，釋放可檢測信號的特點，將CRISPR?C2c2系統應用在腫瘤相關突變基因檢測中，靈敏度高、準確度高，是一種具有巨大商業(yè)應用價值的檢測方法及檢測試劑盒。

技術領域

本發(fā)明涉及基因檢測及基因修飾領域，涉及一種用于特異性靶向腫瘤相關突變基因RNA的gRNA，及一種基于規(guī)律間隔成簇短回文重復序列(CRISPR)系統的腫瘤相關突變基因檢測方法、檢測試劑盒。

背景技術

規(guī)律成簇間隔短回文重復系統(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas)是古菌和細菌的抵抗病毒和質粒侵染的重要免疫防御系統，用來抵抗外源遺傳物質的入侵，比如噬菌體病毒和外源質粒。同時，它為細菌提供了獲得性免疫：這與哺乳動物的獲得性免疫類似，當細菌遭受病毒或者外源質粒入侵時，會產生相應的“記憶”，從而可以抵抗它們的再次入侵。CRISPR/Cas系統可以識別出外源DNA或RNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達。正是由于這種精確的靶向功能，CRISPR/Cas系統被開發(fā)成一種高效的基因編輯工具。

CRISPR-Cas系統劃分為兩大類，第一大類CRISPR-Cas系統由多亞基組成的效應復合物發(fā)揮功能；第二大類是由單個效應蛋白(如Cas9,Cpf1,C2c1等)來發(fā)揮功能。其中，Cas9,Cpf1,C2c1均具有RNA介導的DNA核酸內切酶活性。目前，Cas9和Cpf1蛋白作為基因組編輯工具被廣泛應用，克服了傳統基因編輯技術步驟繁瑣、耗時長、效率低等缺點，以其較少的成分、便捷的操作以及較高的效率滿足了大多數領域的基因編輯需求，并有著潛在且巨大的臨床應用價值。

在自然界中，CRISPR/Cas系統擁有多種類別，其中CRISPR/Cas9系統是研究最深入，應用最成熟的一種類別。CRISPR-Cas9是一種具有核酸內切酶活性的復合體，識別特定的DNA序列，進行特定位點切割造成雙鏈DNA斷裂(Double-strand breaks,DSB)，在沒有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末端連接 (Non-homologous end joining,NHEJ),造成移碼突變(frameshift mutation)，導致基因敲除。CRISPR/Cas9 是繼“鋅指核酸內切酶(ZFN)”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)”之后出現的第三代“基因組定點編輯技術”。憑借著成本低廉，操作方便，效率高等優(yōu)點，CRISPR/Cas9迅速風靡全球的實驗室，成為了生物科研的有力幫手。

CRISPR/Cas是進行基因編輯的強大工具，可以對基因進行定點的精確編輯。在向導RNA(guide RNA， gRNA)和Cas9蛋白的參與下，待編輯的細胞基因組DNA將被看作病毒或外源DNA，被精確剪切。但是， CRISPR/Cas9的應用也有一些限制條件。首先，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對保守的PAM序列(NGG)。其次，向導RNA要與PAM上游的序列堿基互補配對。如果在基因的上下游各設計一條向導RNA(向導 RNA1，向導RNA2)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中，向導RNA通過堿基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。而生物體自身存在著 DNA損傷修復的應答機制，會將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒(供體DNA分子)，這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變。對受精卵細胞進行基因編輯，并將其導入代孕母體中，可以實現基因編輯動物模型的構建。隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術已經被廣泛的應用。除了基因敲除，基因替換等基礎編輯方式，它還可以被用于基因激活，疾病模型構建，甚至是基因治療。