[發(fā)明專利]一種高白細(xì)胞性白血病PDX模型的建立方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810873359.8
• 申請(qǐng)日: 2018-08-02
• 公開（公告）號(hào): CN109022362B
• 公開（公告）日: 2022-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周芙玲;金艷霞;梁雨星;楊倩;丁路;張冬冬;吳八路;潘運(yùn)寶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;A01K67/027
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 唐萬榮;徐曉琴

1.一種高白細(xì)胞性白血病PDX模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)篩選合適的高白細(xì)胞性白血病臨床患者，所述高白細(xì)胞性白血病臨床患者的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：a)年齡18-60歲，白血病患者；b)ECOG行為狀態(tài)評(píng)分為0-2分；c)肝腎功能基本正常；d)外周血中白細(xì)胞WBC≥100×10⁹cells/ml；

(2)采用COM.TEC血細(xì)胞分離機(jī)分離采集步驟(1)所述高白細(xì)胞性白血病臨床患者的外周血中白細(xì)胞；

(3)分離所采集的外周血中白細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞，并將磁珠分選后的CD34+的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，得到白血病細(xì)胞懸液；

(4)制備高白細(xì)胞性白血病PDX模型：首先將小鼠用χ-ray放射線輻照，然后將步驟(3)培養(yǎng)所得白血病細(xì)胞懸液注射至小鼠尾靜脈，一周后通過隨機(jī)抽取小鼠尾巴血液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷模型是否建立成功。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高白細(xì)胞性白血病PDX模型的建立方法，其特征在于，步驟(2)所述血細(xì)胞分離機(jī)分離采集外周血中白細(xì)胞的主要參數(shù)設(shè)置為：

a)白細(xì)胞總數(shù)設(shè)至最大值為120×10E3/UL；

b)每循環(huán)血量：第一個(gè)循環(huán)設(shè)為180ml；第二個(gè)循環(huán)開始，先根據(jù)白細(xì)胞總數(shù)按照下列經(jīng)驗(yàn)值設(shè)定：白細(xì)胞總數(shù)30萬，80-100ml，然后在白膜收集階段時(shí)觀察白膜，若此時(shí)分離腔內(nèi)有剩余白膜，則下調(diào)“V”，每次下調(diào)10ml，直至觀察不到白膜；反之則上調(diào)“V”，每次上調(diào)10ml，但不超過上限180ml；

c)白膜泵出量：25ml；

d)白膜收集量：先設(shè)到10ml，如果收集尾部變淡則減1-2ml，或者按“stop phase”手動(dòng)控制收集截至點(diǎn)；

e)循環(huán)次數(shù)：至少使處理全血量達(dá)到2倍TBV；

f)全血流速：Hct30％時(shí)，50-60ml/min，不超過70ml/min；20％Hct30％時(shí)，不要超過40ml/min；Hct20％時(shí)，不要超過30ml/min；

g)抗凝劑與血液的體積比為1：9；

h)離心機(jī)轉(zhuǎn)速：默認(rèn)值為1500，在機(jī)器默認(rèn)值基礎(chǔ)上增加200；如果需要減少血小板損失，則使用默認(rèn)值即可。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高白細(xì)胞性白血病PDX模型的建立方法，其特征在于，步驟(3)所述分離單個(gè)核細(xì)胞的方法為：將步驟(2)所得白細(xì)胞血樣加入到分離液的液面上，離心分離后，血樣由上至下分為四層：第一層為血漿層、第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層、第三層為透明分離液層、第四層為紅細(xì)胞層，吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，清洗液進(jìn)行清洗后，進(jìn)行磁珠分選得到CD34+的單個(gè)核細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高白細(xì)胞性白血病PDX模型的建立方法，其特征在于，所述分離液為人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高白細(xì)胞性白血病PDX模型的建立方法，其特征在于，步驟(3)中所述培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)基為：含10wt％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高白細(xì)胞性白血病PDX模型的建立方法，其特征在于，步驟(3)中所述培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)條件為：將單個(gè)核細(xì)胞接種至培養(yǎng)基上，置于37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高白細(xì)胞性白血病PDX模型的建立方法，其特征在于，步驟(4)中所述小鼠為4～5周齡的B-NSG雌鼠；所述χ-ray放射線輻照的劑量為1.5～3.5Gy，輻照后6～12h內(nèi)注射白血病細(xì)胞懸液至小鼠尾靜脈；所述注射至小鼠尾靜脈的白血病細(xì)胞懸液中含有1×10⁷～2×10⁷個(gè)Human白血病細(xì)胞。