[發明專利]一種快速的水稻成熟胚原位轉基因方法

在審

• 申請號: 201810871374.9
• 申請日: 2018-08-02
• 公開（公告）號: CN108998469A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 王罡;李倩;季靜;張悅;楊丹
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 天津一同創新知識產權代理事務所(普通合伙) 12231
• 代理人: 陸藝

本發明公開了一種快速的水稻成熟胚原位轉基因方法，包括如下步驟：(1)水稻外植體的獲得；(2)農桿菌侵染液制備；(3)侵染轉化與共培養：用涂抹工具蘸取農桿菌侵染液，涂抹在步驟(1)的水稻胚芽生長點橫切處，在穴盤中鋪入配置好的生長基質，將涂抹后的水稻置于穴盤的生長基質上，再撒上一層生長基質，培養；(4)篩選，PCR檢測：長高至5?7cm后移栽至水田中生長，當小苗在水田中長出4?7片新葉，用濃度為150?180mg/L草甘膦水溶液噴灑葉片，篩選出有抗性的水稻植株，再PCR檢測，鑒定得到成熟胚原位轉基因陽性水稻。本發明的方法簡單、快速、高效，轉化率可達4％。

技術領域

本發明屬于植物基因工程育種領域，具體涉及一種快速的水稻成熟胚原位轉基因方法。

背景技術

水稻(Oryza sativa L.)是一年生禾本科植物，草本稻屬的一種，也是稻屬中作為糧食的最主要最悠久的一種。水稻是世界四大糧食作物之一，同時又是植物遺傳學研究的重要模式植物之一。水稻的生產及其相關產業直接關系到國計民生。和我國其他農作物一樣，水稻在種植生產過程中也面臨著諸如農藥污染嚴重、水資源短缺、土地鹽堿化等一系列問題。近年來，水稻轉基因技術在實現上述育種目標的進程中發揮著重要的作用。轉基因技術是指利用現代分子生物學方法分離克隆目標性狀基因，然后通過相應的轉化手段將其導入到受體生物中并且能持續穩定遺傳并表達，從而改良受體生物原有的性狀或賦予其新的性狀。

水稻遺傳轉化的主流方法為農桿菌介導的遺傳轉化法，其優點為操作簡便、轉化系統穩定、外源基因拷貝數較低等。l993-1994年，農桿菌介導的水稻遺傳轉化研究取得了重大突破，研究者首次通過農桿菌介導獲得了轉基因水稻植株。由于農桿菌介導的遺傳轉化方法主要是通過誘導愈傷的組織培養方法實現，而水稻組織培養的基因型依賴性很強，同時水稻組織培養再生體系仍普遍存在再生率低、重復性差、基因型依賴強、培養條件煩瑣等問題，在很大程度上限制了利用基因工程手段對水稻的遺傳改良。因此，亟需一種簡便、高效的水稻遺傳轉化方法，這對水稻分子生物學研究和遺傳改良具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是克服現有轉化技術的不足，提供一種快速的水稻成熟胚原位轉基因方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種快速的水稻成熟胚原位轉基因方法，包括以下步驟：

(1)水稻外植體的獲得：

挑取種皮完整且干燥的水稻成熟種子，在水中浸泡60-72小時，取出，再浸入體積濃度為5％-8％次氯酸鈉水溶液中，放置15-18分鐘，用無菌水漂洗2-4次；在容器中，鋪無菌濾紙，將漂洗后的種子鋪在無菌濾紙上，加入無菌水沒過種子，于28-30℃培養36-48小時；挑選出帶有1-2cm胚芽的水稻個體，用滅菌的手術刀在胚芽生長點處橫切；

(2)農桿菌侵染液制備：

在超凈工作臺用移液槍吸取-80℃保存的含有目的基因Bar的農桿菌儲存液200-300μL，加入到2-5mL滅菌的LB液體培養基中，置于25-28℃搖床中，150-200r/min，進行活化培養24-28h，得到活化的農桿菌菌液；吸取1-1.5mL活化的農桿菌菌液加入到25-30mL滅菌的LB液體培養基中進行擴大培養，至OD₆₀₀＝0.3-0.4的擴大培養的菌液，取25-30mL擴大培養的菌液置于滅菌的50mL離心管中，5000-8000r/min，25-28℃離心8-10min，收集菌體，將菌體重懸于50-100mL濃度為200-250μM乙酰丁香酮水溶液中，得到農桿菌侵染液；

(3)侵染轉化與共培養：

用涂抹工具蘸取農桿菌侵染液，涂抹在步驟(1)的水稻胚芽生長點橫切處，在穴盤中鋪入配置好的生長基質，將涂抹后的水稻置于穴盤的生長基質上，再撒上一層生長基質，28-30℃培養；

(4)篩選，PCR檢測：