[發明專利]一種快速的水稻成熟胚原位轉基因方法

在審

• 申請號: 201810871374.9
• 申請日: 2018-08-02
• 公開（公告）號: CN108998469A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 王罡;李倩;季靜;張悅;楊丹
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 天津一同創新知識產權代理事務所(普通合伙) 12231
• 代理人: 陸藝

1.一種快速的水稻成熟胚原位轉基因方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)水稻外植體的獲得：

挑取種皮完整且干燥的水稻成熟種子，在水中浸泡60-72小時，取出，再浸入體積濃度為5％-8％次氯酸鈉水溶液中，放置15-18分鐘，用無菌水漂洗2-4次；在容器中，鋪無菌濾紙，將漂洗后的種子鋪在無菌濾紙上，加入無菌水沒過種子，于28-30℃培養36-48小時；挑選出帶有1-2cm胚芽的水稻個體，用滅菌的手術刀在胚芽生長點處橫切；

(2)農桿菌侵染液制備：

在超凈工作臺用移液槍吸取-80℃保存的含有目的基因Bar的農桿菌儲存液200-300μL，加入到2-5mL滅菌的LB液體培養基中，置于25-28℃搖床中，150-200r/min，進行活化培養24-28h，得到活化的農桿菌菌液；吸取1-1.5mL活化的農桿菌菌液加入到25-30mL滅菌的LB液體培養基中進行擴大培養，至OD₆₀₀＝0.3-0.4的擴大培養的菌液，取25-30mL擴大培養的菌液置于滅菌的50mL離心管中，5000-8000r/min，25-28℃離心8-10min，收集菌體，將菌體重懸于50-100mL濃度為200-250μM乙酰丁香酮水溶液中，得到農桿菌侵染液；

(3)侵染轉化與共培養：

用涂抹工具蘸取農桿菌侵染液，涂抹在步驟(1)的水稻胚芽生長點橫切處，在穴盤中鋪入配置好的生長基質，將涂抹后的水稻置于穴盤的生長基質上，再撒上一層生長基質，28-30℃培養；

(4)篩選，PCR檢測：

長高至5-7cm后移栽至水田中生長，當小苗在水田中長出4-7片新葉，用濃度為150-180mg/L草甘膦水溶液噴灑葉片，篩選出有抗性的水稻植株，再PCR檢測，鑒定得到成熟胚原位轉基因陽性水稻。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述生長基質為質量比3：2：1的營養土、蛭石和珍珠巖的混合物。