[發明專利]一種提高堿性蛋白酶發酵活力的生產方法

在審

• 申請號: 201810870244.3
• 申請日: 2018-08-02
• 公開（公告）號: CN108949731A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 孫利鵬;焦國寶;管寧;陳曉宇
• 申請（專利權）人: 河南新仰韶生物微生態有限公司
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N1/20;C12R1/10
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

本申請屬于微生物發酵工程技術領域，具體涉及一種提高堿性蛋白酶發酵活力的生產方法。該方法包括菌種活化、種子培養、發酵制備堿性蛋白酶等步驟。其中發酵制備堿性蛋白酶所采用的發酵培養基中含有：玉米淀粉或可溶性淀粉1.5~3.5%、棉仁蛋白粉0.5~2.5%、磷酸氫二鈉0.1~0.3%、磷酸二氫鉀0.1~0.2%、氯化鈣0.02~0.03%。本申請中，通過對發酵工藝及發酵培養基進行優化，尤其是在發酵后期通過補充特定營養糖和氮源等營養成分，較好提高了發酵活力。測定結果表明，本申請通過工藝優化后，發酵活力可達5.8萬U/mL以上，遠高于現有的3.5萬U/mL的發酵水平，表現出較好的提升效果。

技術領域

本申請屬于微生物發酵工程技術領域，具體涉及一種提高堿性蛋白酶發酵活力的生產方法。

背景技術

堿性蛋白酶（Alkaline Protease）是一類適宜于在堿性條件下水解蛋白質肽鍵的酶類，廣泛存在于動、植物及微生物生物體中，在豬的胰臟中最早被發現。研究表明，堿性蛋白酶大都屬于絲氨酸蛋白酶，酶活性中心含有絲氨酸，等電點pI值多數在8.0左右，其分子量一般在15-40 kDa。

堿性蛋白酶作為一類重要的工業用酶，廣泛應用于食品、醫藥、皮革、洗滌劑、釀造等行業，其最大用途是作為添加劑生產加酶洗滌劑。而食品方面的應用主要用于蛋白類食品的發酵、肉類嫩化、酒精澄清等。由于用途及應用范圍十分廣泛，因此產業內每年對堿性蛋白酶的需求量都很大，并呈持續增長趨勢，為此，如何持續提高堿性蛋白酶的發酵活力及提高堿性蛋白酶產量是業內迫切需要關注和解決的技術問題。

發明內容

本申請目的在于提供一種提高堿性蛋白酶發酵活力的生產方法，從而為堿性蛋白酶的生產、應用奠定基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

一種提高堿性蛋白酶發酵活力的生產方法，該方法具體包括如下生產步驟：

（1）菌種活化

以地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）作為發酵菌株，首先將低溫冰箱中保存的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）原種接種到LB平板培養基上，37℃恒溫培養24小時以進行菌種復蘇，然后將活化后地衣芽孢桿菌接入斜面培養基，好氧條件下35~38℃培養28~36h以進行活化菌株；

所述斜面培養基，為固態，質量百分含量計，具體組成為：蛋白胨 0.4%，牛肉膏 0.2%，磷酸二氫鉀0.3%，瓊脂1.6%，pH自然；

所述地衣芽孢桿菌發酵菌株具體例如采用中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏號為CICC 10266的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）菌株；

（2）種子培養

將步驟（1）中復蘇、活化后菌種接入種子培養基中（質量比例計，接種量0.5~2%），35~38℃恒溫、180~250r/min轉速搖床培養28~37h，以此作為種子液；

所述種子培養基，為液態，以質量百分比計，培養基中含有：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化鈉1%、葡萄糖2%；

將種子液按1~3%的體積比例接種入含有滅菌后一級種子培養基的發酵罐中，35~38℃、210~270 r /min（優選37℃、180 r /min）發酵培養20~30h，以此作為一級種子液；

所述一級種子培養基，以質量百分含量計，培養基組成為：葡萄糖0.5%，玉米淀粉2%，棉仁蛋白粉 1.2%，磷酸二氫鉀0.2%，pH自然；

發酵過程中，發酵罐壓保持在0.05~0.08Mpa，發酵液與通氣量比（V/V?min）為1：0.45~0.8（優選1：0.6）；