[發明專利]一種三維腫瘤球培養基添加劑、培養基以及三維腫瘤球培養方法

在審

• 申請號: 201810868902.5
• 申請日: 2018-08-02
• 公開（公告）號: CN108998441A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 朱震威
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學深圳醫院
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

本發明提供了一種三維腫瘤球培養基添加劑、培養基以及三維腫瘤球培養方法。所述添加劑由增稠劑和凝膠劑組成，增稠劑選自甲基纖維素、乙基纖維素、基底膜基質、膠原蛋白中的一種或多種的組合，凝膠劑選自結冷腳、海藻酸或瓊脂糖凝膠中的一種或多種的組合。所述三維腫瘤球的培養基，包括腫瘤細胞培養基和前述的三維腫瘤球培養基添加劑。多種細胞系結果顯示本發明培養基可在高密度培養中，明顯降低腫瘤球聚集、融合。

技術領域

發明涉及生物領域，具體涉及一種制備腫瘤球的培養基及其腫瘤球大量三維(3D)制備的方法。

背景技術

腫瘤干細胞(Cancer stem cells)理論認為腫瘤組織中有一群具有干細胞性質的腫瘤細胞，它們才是腫瘤發生、發展、復發、轉移的根本原因。腫瘤球培養是目前最為常用的培養和富集腫瘤干細胞、鑒定細胞干性能力的方法。都是在無血清和非貼壁環境(超低粘附皿)下進行培養，經一周左右培養其中部分具有“干性”特征細胞形成腫瘤球。培養方案有多種，如經典的DMEM/F12+20ng/ml EGF+20ng/ml FGF+2％B27方案。具體所添加的成分包括：表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、白細胞抑制因子(LIF)、B27、胰島素、轉化生長因子-β(TGF-β)等。

現有技術所采用的傳統的腫瘤球培養法容易發生聚集、粘附、成團，失去腫瘤球單細胞來源的特征，且腫瘤球培養量少，費用高，操作難度大。

發明內容

本發明的一個目的在于，提供一種三維(3D)腫瘤球培養基添加劑。

本發明的第二個目的在于，提供一種三維腫瘤球培養基。

本發明的第三個目的在于，提供一種三維腫瘤球培養方法。

根據本發明的一個方面，提供一種三維腫瘤球培養基添加劑，其由增稠劑和凝膠劑組成；

發明人認為傳統細胞懸浮培養基中，由于在非貼壁環境下，細胞生長中無附著點，在外界微小作用力下便會出現移動進而導致聚集、粘附、成團。由于腫瘤球容易聚集、粘附因此在實際的應用中常通過降低細胞接種數量來較少以上現象；這就導致培養的腫瘤球量比較少。而本發明意外的發現通過加入增稠劑和凝膠劑兩種生物材料就能實現高密度、大量培養腫瘤球的目的。

增稠劑可增加培養基黏度從而限制腫瘤球在各方向上的運動，凝膠劑具有促凝膠作用使培養基產生一定硬度進而控制腫瘤球的沉降速度，產生3D培養的效果。

進一步地，增稠劑選自甲基纖維素(MC)、乙基纖維素、基底膜基質、膠原蛋白中的一種或多種的組合；凝膠劑選自結冷膠、海藻酸或瓊脂糖凝膠中的一種或多種的組合；

再進一步地，所述增稠劑與凝膠劑的質量比例為1-100：1，優選為5-15：1，更優選為10：1；

使用添加劑時，所述增稠劑與培養基的質量體積比為0.1-0.5％，優選為0.3％；凝膠劑與培養基的質量體積比為0.01％-0.05％，優選為0.03％。

根據本發明的又一個方面，提供了一種三維腫瘤球的培養基，其包括腫瘤細胞培養基和前述的三維腫瘤球培養基添加劑，所述腫瘤細胞培養基選自本領域常用的任意細胞培養基，優選為無血清腫瘤球培養基；

進一步地，本發明的三維腫瘤球的培養基為在DMEM/F12中加入EGF、FGF、B27、0.3％的甲基纖維素(MC)和0.03％結冷腳(GG)制成；

再進一步地，本發明的三維腫瘤球的培養基為在DMEM/F12中加入20ng/ml的EG F、20ng/ml的FGF、2％的B27(將商品B27溶液按照體積1:50添加)、0.3％的甲基纖維素(MC)和0.03％結冷膠(GG)制成；

本發明所述三維腫瘤球培養基的制備方法包括如下步驟：