[發(fā)明專利]高分子量絲素蛋白鏈段的制備方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201810867500.3 | 申請(qǐng)日： | 2018-08-02 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN108948171B | 公開（公告）日： | 2023-06-27 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 盧神州;劉凱;姜福建;李明忠 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 南通紡織絲綢產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院;蘇州大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C07K14/435 | 分類號(hào)： | C07K14/435;C07K1/14;C07K1/34 |
| 代理公司： | 蘇州謹(jǐn)和知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32295 | 代理人： | 田媛 |
| 地址： | 226000 江蘇*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 分子量 絲素 蛋白 制備 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種高分子量絲素蛋白多肽鏈段的制備方法，采用蠶繭殼脫膠溶解后，加入還原劑還原絲素蛋白中半胱氨酸，將絲素蛋白中的H鏈（390kDa）和L鏈（25kDa）之間的二硫鍵打開，并且在氮?dú)獗Ｗo(hù)的還原性環(huán)境下，采用半透膜分離方法，透析去除低分子量部分的絲素蛋白多肽鏈，獲得絲素蛋白中的H鏈成分。本發(fā)明的這種方法分離效率高，不會(huì)影響絲素蛋白多肽的生物活性，絲素蛋白中的H鏈成分，免疫原性低，可用于作為生物醫(yī)用材料，具有巨大的市場前景和發(fā)展?jié)撃堋?/p>
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及蛋白提純領(lǐng)域，特別地，是一種高分子量絲素蛋白鏈段萃取和制備的有效方法。
背景技術(shù)
絲素蛋白是一種亞單元結(jié)構(gòu)，在構(gòu)成上包括一條名為H鏈(390kDa)的長鏈，一條名為L鏈(25kDa)的短鏈和糖蛋白鏈P25（30kDa），其中H鏈依靠二硫鍵與L鏈相連。依靠疏水作用，每6個(gè)H-L鏈的集合與一個(gè)P25糖蛋白組合形成一個(gè)基本單元，比例為H:L:P25?=?6:6:1。在組成上包括18種氨基酸，其中以甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸為主，約占總含量的80%。絲素蛋白作為一種天然高分子材料，具有非常優(yōu)異的性能。例如絲素蛋白具有良好的生物相容性、生物降解性、良好的力學(xué)性能等，可以被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞，在組織工程中，用以維持具有預(yù)制形狀的新生組織的力學(xué)形態(tài)。絲素蛋白的三條多肽鏈中，H鏈?zhǔn)杷暂^強(qiáng)，容易形成β-折疊結(jié)構(gòu)，結(jié)晶性較強(qiáng)；而其他兩條多肽鏈則親水性較強(qiáng)，容易形成水凝膠。如果能夠分離這兩種多肽，獲得小分子量多肽部分，則能夠獲得親水性絲素蛋白多肽鏈，用于制備親水性材料。
目前對(duì)于絲素蛋白不同鏈段的分離的報(bào)道較少。方法大致為：（1）改變脫膠方法：增加Na2CO3的用量，打斷絲素蛋白分子鏈段之間分子作用力（2）溶解方法CaCl2-乙醇三元溶液體系溶解，酸、堿、酶水解；（3）層析分離技術(shù)：使用不同分子量的葡聚糖分子篩對(duì)目的蛋白進(jìn)行篩選；以上方法雖然具有一定的可行性，但是局限性也比較大。例如：1、改變脫膠工藝和溶解方式的方法，其已經(jīng)將絲素蛋白分子鏈段打散，也就是說H鏈段、L鏈段和P25鏈段已經(jīng)斷裂開來，變得不再完整，分子量分布較寬，沒有進(jìn)行真正意義上的分離純化，所得到的不同分子量鏈段，也無法知曉其原屬于哪一段分子鏈。2、采用凝膠層析過濾的方法，對(duì)于實(shí)驗(yàn)員操作水平要求高，葡聚糖凝膠分子篩容易堵塞，產(chǎn)量低，分離效率慢，再者說，如果不將半胱氨酸形成的二硫鍵斷裂開，絲素蛋白中的重鏈和輕鏈不會(huì)分開，在層析過程中就不會(huì)產(chǎn)生速度差，也就導(dǎo)致重鏈會(huì)連接輕鏈一起層析出來，不會(huì)達(dá)到真正意義上的分離。
在本發(fā)明之前，許多研究人員都是增大Na2CO3的用量或者使用CaCL2-乙醇三元溶液體系將絲素蛋白打散，獲得分子量分布寬連續(xù)的混合溶液，在對(duì)溶液進(jìn)行分離，極大地破壞了絲素蛋白分子鏈段的完整性。例如：顏若曦等人《一種中分子量水溶性絲素蛋白的制備》，利用CaCL2-乙醇-水體系對(duì)絲素蛋白降解，再通過凝膠過濾層析方法來獲得50?kDa左右的絲素蛋白分子鏈段，由于CaCL2-乙醇-水體系溶解過程中，絲素分子鏈段已被打散，再使用層析柱的方法獲得50?kDa左右的絲素蛋白分子，此方法已完全破壞絲素蛋白分子鏈的完整性。公開號(hào)為CN107722116A中國發(fā)明專利提供了一種小分子量的絲素肽的分離方法，采用多種類別的葡聚糖分子篩，建立分子篩柱對(duì)絲素多肽進(jìn)行梯度分離，但此方法操作步驟繁瑣，對(duì)于操作人員要求高，難以獲得完整的高分子量絲素蛋白。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述存在的不足，本發(fā)明的目的提供一種高分子量絲素蛋白鏈段的制備方法，能夠保證絲素蛋白高分子鏈段的完整性且可以快速大批量獲得高分子量絲素蛋白，效率高，產(chǎn)量大。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種高分子量絲素蛋白多肽鏈段的制備方法，包括以下步驟：
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