[發明專利]一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法

有效

• 申請號: 201810867025.X
• 申請日: 2018-08-01
• 公開（公告）號: CN108949847B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 張曉玲;楊橋;穆軍;蔣志偉;張若男
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

本發明涉及海洋微生物發酵技術領域，尤其涉及一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法，包括以下步驟：(1)搖瓶種子液；(2)種子液的準備；(3)發酵液培養；(4)發酵液的萃取提純；(5)粗提物的純化：經制備液相色譜洗脫，收集，旋轉蒸發，獲得白色粉末，即得膝溝藻毒素。本發明采用微生物菌株發酵產生膝溝藻毒素發酵周期短，僅為36?40小時，可有效節省能耗；采用微生物菌株發酵產生膝溝藻毒素，產率較高，可達到6μg/L以上；方法步驟簡單、工作量小，周期較短，所用試劑與材料均為微生物發酵試驗常用試劑，對人體無害，對環境友好，成本低，具有較高的市場前景與經濟價值。

技術領域

本發明涉及海洋微生物發酵技術領域，尤其涉及一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法。

背景技術

膝溝藻毒素(gonyautoxins，GTXs)是麻痹性貝類毒素中的一種，其主要包括GTX1、GTX2、GTX3及GTX4同系物，屬胍胺類神經毒素，是特異性鈉離子通道阻斷劑。GTXs在有害赤潮檢測、神經生理學、醫學診斷、藥物開發、生化戰劑等研究中均有重要應用。在醫學診斷與藥物開發方面，因其獨特的化學結構和毒理作用機制，成為研究細胞Na⁺通道的一種重要工具藥，且具有高效的鎮痛、麻醉、解痙、降壓、止喘等多種功效，是海洋新藥開發的重要先導化合物。部分海洋甲藻、淡水藍藻及海洋細菌均可產生GTXs。

目前，GTXs主要通過產毒海洋甲藻如微小亞歷山大藻的培養及發酵代謝產物提取制備獲得。該方法不僅培養周期長、成本高，且需要特殊的藻培養設備。而與甲藻相比，海洋細菌具有基因組小、易培養、遺傳操作簡單等特性。因此，利用海洋細菌發酵產生及制備膝溝藻毒素，是一種經濟、高效的替代方法。

發明內容

本發明為了克服現有技術的不足，提供一種發酵周期短、成本低的海洋微生物發酵法產生制備膝溝藻毒素的方法。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法，包括以下步驟：

(1)搖瓶種子液；取保存于固體斜面的硝酸鹽還原菌(Nitratireductor sp.)LZ3-1菌種，接種于裝有無菌培養液的1L錐形三角瓶中，裝液量：300mL，30℃培養12小時，取培養物進行鏡檢，確認菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中；

(2)種子液的準備：按搖瓶種子液的配方配制培養液5L，加入種子罐中，通蒸汽加熱，121℃滅菌30分鐘，冷卻至30℃，用火焰法接種，將搖瓶種子液接種于種子罐中的種子培養基上，通氣量60L/min，攪拌轉速100/min，30℃培養16小時，取培養物進行鏡檢，確認菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于發酵罐中；

(3)發酵液培養：按發酵罐的配方，配制培養液20L，加入50L的發酵罐中，通蒸汽加熱，121℃滅菌30分鐘，冷卻至30℃，將種子液通過管道接種于發酵罐中的發酵培養基上，維持通氣量50-70L/min，攪拌轉速160-180轉/min，進行發酵培養，得到含有膝溝藻毒素的發酵液；

(4)發酵液的萃取提純：將步驟(3)所得的發酵液經板框過濾后得細胞沉淀，加入10L的乙醇溶液進行產物提取，將提取液通過0.45微米濾膜過濾，對沉淀進行二次提取，得到二次提取液；將二次澄清液經0.45微米濾膜過濾后，加入10L的乙醇溶液進行三次提取，合并三次提取液，旋蒸濃縮，得到粗提取；

(5)粗提物的純化：將步驟(4)得到的粗提物，經制備液相色譜洗脫，收集，旋轉蒸發，獲得白色粉末，即得膝溝藻毒素。

本發明方法中所用的硝酸鹽還原菌(Nitratireductor sp.)LZ3-1(CCTCC AB2017227)購買自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。

作為優選，步驟(2)中，所述種子培養基的成分為：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸二氫鉀0.05g和天然海水1L。