[發明專利]一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法

有效

• 申請號: 201810867025.X
• 申請日: 2018-08-01
• 公開（公告）號: CN108949847B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 張曉玲;楊橋;穆軍;蔣志偉;張若男
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）搖瓶種子液：取保存于固體斜面的硝酸鹽還原菌（Nitratireductor sp.）LZ3-1菌種，接種于裝有無菌培養液的1L錐形三角瓶中，裝液量：300 mL，30℃培養12小時，取培養物進行鏡檢，確認菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中；所述硝酸鹽還原菌（Nitratireductor sp.）LZ3-1菌種已于2017年10月18日保藏于中國典型培養物中心CCTCC，其保藏編號為：CCTCC AB 2017227；

（2）種子液的準備：按搖瓶種子液的配方配制培養液5L，加入種子罐中，通蒸汽加熱，121℃滅菌30分鐘，冷卻至30℃，用火焰法接種，將搖瓶種子液接種于種子罐中的種子培養基上，通氣量60 L/min，攪拌轉速100/min，30℃培養16小時，取培養物進行鏡檢，確認菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于發酵罐中；所述種子培養基的成分為：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸二氫鉀0.05g和天然海水1L；

（3）發酵液培養：按發酵罐的配方，配制培養液20L，加入50L的發酵罐中，通蒸汽加熱，121℃滅菌30分鐘，冷卻至30℃，將種子液通過管道接種于發酵罐中的發酵培養基上，維持通氣量50-70 L/min，攪拌轉速160-180轉/min，進行發酵培養，得到含有膝溝藻毒素的發酵液；所述發酵培養基的成分為：蛋白胨 8g，酵母膏 3.5g，磷酸二氫鉀0.1g，氯化鈉 0.05g，氯化鈣 0.01g，精氨酸0.005g，蛋氨酸0.001g，維生素B1 0.005g和天然海水1000 mL；

（4）發酵液的萃取提純：將步驟（3）所得的發酵液經板框過濾后得細胞沉淀，加入乙醇溶液進行提取，將提取液旋蒸濃縮，得到粗提物；

（5）粗提物的純化：將步驟（4）得到的粗提物，經制備液相色譜洗脫，收集，旋轉蒸發，獲得白色粉末，即得膝溝藻毒素。

2.根據權利要求1所述的一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法，其特征在于，步驟（2）中，所述種子培養基的pH為7.5。

3.根據權利要求1所述的一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法，其特征在于，步驟（3）中，所述發酵培養基的pH為7.2。

4.根據權利要求1或3所述的一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法，其特征在于，步驟（3）中，發酵培養的溫度為30℃，培養時間為36~40h。

5.根據權利要求1所述的一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法，其特征在于，步驟（4）中，所述乙醇溶液的體積濃度為75%。

6.根據權利要求1或5所述的一種利用海洋細菌發酵制備膝溝藻毒素的方法，其特征在于，步驟（4）中，所述乙醇溶液的pH為5.5。