[發明專利]一種提高分枝桿菌輔酶再生同時促進雄烯二酮生產的方法

在審

• 申請號: 201810861279.0
• 申請日: 2018-08-01
• 公開（公告）號: CN108913643A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 申雁冰;王敏;蘇立秋;夏夢雷;駱健美;商志華;許雙平
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/53;C12P33/02;C12R1/32
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物催化技術領域，具體涉及一種提高分枝桿菌輔酶再生同時促進雄烯二酮生產的方法。本發明將植物甾醇代謝途徑中甾醇C27位單加氧酶Cyp125引入到甾體轉化微生物中，以提高重組微生物在發酵系統中雄烯二酮的轉化效率，為解決菌體植物甾醇代謝緩慢提供了新方法。Cyp125的過表達促進分枝桿菌甾醇C27單加氧酶比酶活提高了22.2％，提高了胞內NAD⁺的再生，使胞內NAD⁺/NADH比例提高131％，同時意外的發現該酶的過表達使菌體生物量提高18.7％，最終達到使轉化周期縮短24h，AD(D)產量提高10.0％的效果。

技術領域：

本發明屬于生物催化技術領域，具體涉及一種提高分枝桿菌輔酶再生同時促進雄烯二酮生產的方法。

背景技術：

雄烯二酮，雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，是生產可的松、鹽皮質激素類藥物、常規口服避孕藥和蛋白同化激素等其他甾體激素類藥物的重要中間體，可以通過微生物降解植物甾醇側鏈獲得。植物甾醇代謝生成AD(D)的代謝途徑復雜，不僅受自身代謝途徑的影響也受胞內輔酶的調控。目前基于植物甾醇代謝途徑分析提高AD(D)生產的策略主要包括：1、植物甾醇代謝途徑中關鍵酶的改造；2、對植物甾醇代謝途徑依賴的輔酶再生系統進行調控。

關于植物甾醇代謝途徑中酶的改造，主要集中于通過過表達或敲除植物甾醇氧化途徑中的酶來提高AD(D)生產效率及產量。例如過表達膽固醇氧化酶及3β-羥基甾體脫氫酶等，或失活3-酮甾體-9α-羥化酶以及3-酮甾體-1-脫氫酶。研究結果顯示敲除某基因以后，會在不同程度上降低植物甾醇的轉化率和產率，即造成菌體整體生產強度的下降。因此還需要從菌體整體代謝調控方面深入探索、系統研究，以尋求提高雄烯二酮生產效率的方法。植物甾醇代謝途徑中許多關鍵酶屬于輔酶依賴型酶，輔因子依賴的代謝途徑不僅受代謝途徑中酶的控制，而且還受輔因子濃度及輔因子氧化還原態比例的控制。前期研究通過調控微生物中輔酶再生系統來促進AD(D)生產效率，通過過表達NADH氧化酶促進胞內NAD⁺的再生，結果表明AD(D)的生成量有所提高，但是菌體生長受到了明顯的抑制，使AD(D)的生產周期延長(Su LQ,Shen YB,Zhang WK,Gao T,Shang ZH,Wang M(2017)Cofactor engineeringto regulate NAD⁺/NADH ratio with its application to phytosterolsbiotransformation.Microb Cell Fact 16(1):182-192)。

微生物甾醇或膽固醇側鏈降解開始于C27位羥基化進而氧化為C27位羧酸，甾醇C27單加氧酶(Cyp125)屬于細胞色素P450酶，依賴NADH為輔酶催化甾醇側鏈末端C進行連續的氧化反應，起始甾醇側鏈降解途徑。

發明內容：

為了解決上述問題，探索一種提高分枝桿菌AD(D)生產效率的方法，對植物甾醇代謝途徑及調控途徑綜合考慮是有必要的。植物甾醇代謝途徑中甾醇C27位單加氧酶Cyp125是依賴還原型輔酶NADH的酶，屬于植物甾醇側鏈降解途徑初始酶，本發明將其引入到甾體轉化微生物中，以提高重組微生物在發酵系統中雄烯二酮的轉化效率，為解決菌體植物甾醇代謝緩慢提供了新方法。

本發明實現上述目的的技術方案如下：一種產雄烯二酮的基因工程菌，是以新金分枝桿菌為宿主細胞，過表達甾醇C27單加氧酶基因cyp125-3獲得的；

所述cyp125-3的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

優選地，所述宿主細胞為新金分枝桿菌(Mycobacterium sp.)MNR M3，該菌株可從中國工業微生物菌種保藏管理中心(簡稱CICC)購買獲得，編號CICC 21097；

優選地，表達載體為質粒pMV306；