[發明專利]一種檢測TRECs和KRECs基因的實時熒光定量PCR試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201810857790.3
• 申請日: 2018-07-31
• 公開（公告）號: CN108998511A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 朱智;李艷艷;歐恩智;陳珺
• 申請（專利權）人: 朱智;陳珺
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海滬慧律師事務所 31311
• 代理人: 朱九皋

本發明涉及一種用于檢測TRECs和KRECs基因的實時熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒中包括：1)DNA提取試劑，2)包含TRECs基因、KRECs基因和TRAC基因插入序列的標準品，3)包含TRECs基因、TRAC基因的熒光PCR引物和檢測探針的熒光PCR反應液I，4)包含KRECs基因、TRAC基因的熒光PCR引物和檢測探針的熒光PCR反應液II。本發明的試劑盒靈敏度高，特異性好，檢測方法簡單快捷，實驗結果可靠，不僅可以篩查SCID和抗體缺乏為主的免疫缺陷病，而且能夠為其他與T細胞和B細胞發育相關的原發性免疫缺陷病或其他系統疾病提供臨床相關指征，有利于早期診斷及治療。

技術領域

本發明屬于體外核酸診斷領域，涉及一種檢測T細胞受體切除環(T-cellreceptor excision circles，TRECs)和K-刪除重組切除環(K-deleting recombinationexcision circles，KRECs)基因的實時熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒及其應用。

背景技術

重癥聯合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease,SCID)是聯合免疫缺陷病中最嚴重的類型，患者常常在出生后1年內死亡。根據國外大范圍篩查得出SCID的發生率約為1/58000活產新生兒，顯著高于以往認為的1/100000。SCID是由多種遺傳因素引起的T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞數量缺乏和(或)功能障礙，導致體液免疫、細胞免疫同時存在嚴重缺陷，這種原發性免疫缺陷常被定義為初始T細胞缺乏。不經治療，SCID的病死率為100％。目前常用的治療方法為造血干細胞移植(hematopoietic stem celltransplantation,HSCT)、基因治療(gene therapy,GT)或酶替代治療(enzymereplacement therapy,ERT)進行免疫重建。Pai等通過隨訪240例移植后的SCID患者，認為<3.5月齡的 SCID患者移植的存活率顯著高于>3.5月齡或繼發感染的患兒，且移植后的存活率主要與患兒有無感染相關，與移植物的來源無明顯關聯。因此，對SCID患者進行早期診斷及早期治療，可顯著改善患兒的預后。

SCID患兒多數存在T細胞缺乏，因此淋巴細胞絕對計數可作為SCID的篩查手段之一。 Chan和Puck在2005年首先報道了采用定量PCR方法檢測T細胞受體切除環(T－cellreceptor excision circles,TRECs)。TRECs是TCR形成過程中產生的無功能的DNA片段，約70％的αβTCR在生成過程中可同時生成TRECs，這些DNA片段不隨T細胞的分裂而復制，穩定存在于細胞內，因此TRECs定量可以間接反映胸腺輸出的初始T淋巴細胞數量。若 TRECs減少或缺失，則高度懷疑SCID，進一步進行流式細胞及基因診斷確診。通過TRECs 篩查SCID可以與其他新生兒常規篩查項目共用干血紙片，有利于該篩查方法的正式大范圍推廣。除了SCID外，TRECs檢測還能發現包括21三體、DiGeorge綜合征、特發性T淋巴細胞減少癥等其他引起T淋巴細胞計數嚴重減少的疾病。

TRECs檢測價格便宜，包括設備、勞務和試劑等所需要的費用約為4.25美元/嬰兒，與其他篩查項目價格相當或更低；方法高度敏感、特異，篩選試驗的靈敏度接近100％，可有效檢出SCID患兒；因此采用TRECs進行SCID新生兒篩查可有效應用到公共衛生事業，被認為是美國國家標準的新生兒篩查項目。

一些非特異、表現延遲的SCID患者出生時僅通過TRECs檢測可能遺漏，需要K－刪除重組切除環等其他檢測手段協診。KRECs是B細胞成熟過程中，編碼B細胞受體基因重排時產生的非復制的小片段DNA產物，可以作為伴有B細胞數量減少的B淋巴細胞免疫缺陷的篩查方法。例如延遲性ADA患者中，T細胞分裂可能對有毒代謝產物增加的耐受性較好，而B細胞則更容易裂解，KRECs有利于此類患者的早期發現；KRECs在X－連鎖無丙種球蛋白血癥(XLA)的篩查中也發揮著重要作用。理想情況下，應該聯合TRECs－KRECs 進行新生兒免疫缺陷的篩查。