[發明專利]一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法

有效

• 申請號: 201810853978.0
• 申請日: 2018-07-30
• 公開（公告）號: CN109085230B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 趙向輝;劉嬋娟;瞿明仁;黎力之;潘珂
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法，包括以下步驟：步驟(1)制備待測定的木聚糖酶液樣品；步驟(2)在垂直電泳槽內制備分離膠，再在分離膠上層上制備具有樣品槽的濃縮膠層；步驟(3)在濃縮膠的樣品槽中點樣后，對垂直電泳槽施加電壓，跑膠；步驟(4)利用割膠板將樣品所在泳道的膠切成條狀，去除濃縮膠，保留分離膠，即獲得包含樣品的條狀分離膠；將包含樣品的條狀分離膠，放入乙酸鈉溶液中，孵育；步驟(5)將孵育后的包含樣品的條狀分離膠緊密貼在培養皿中的底物膠的膠面上，將培養皿放置在30?50℃的生化培養箱中，培養1?36小時，直至有清晰的條帶和透明圈出現。本發明中操作簡單，且采用同一塊膠，能夠同時鑒定出木聚糖酶蛋白條帶及活性。

技術領域

本發明涉及檢測技術領域，更具體的說是涉及一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法。

背景技術

木聚糖是一種植物細胞壁多糖，約占植物細胞干物質的15-35％，是植物半纖維素的主要成分，廣泛存在于秸稈、麥麩、玉米芯等農業副產物中，含量非常豐富。通過木聚糖酶可將木聚糖分解成不同長度的低聚木糖和木糖，進而使這些資源被充分利用，發揮其潛在的應用價值。木聚糖酶已廣泛應用于飼料、食品、造紙和能源等領域，帶來了很大的經濟效益。

目前木聚糖酶的生產主要來源于微生物發酵，包括自然界中分泌木聚糖酶的微生物以及利用基因工程技術構建的含重組木聚糖酶基因的工程菌(陳洪洋等，木聚糖酶的研究進展，中國釀造，2016(11)：1-5)。在利用微生物生產木聚糖酶過程中，往往需要對木聚糖酶的特性、活性、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳膠(Native-Page)中的位置、以及是否存在同工酶等情況進行鑒定，以便與木聚糖酶的純化，這需要酶譜技術。酶譜技術是利用電泳技術結合特異的酶促化學反應顯色對酶及其同工酶進行分析的方法。根據酶蛋白分子的大小和所帶電荷量的不同，通過電泳使之分離，并利用酶的催化活性作用于底物，用不同方法顯現出酶蛋白的特征性電泳譜帶(酶譜)后進行判型(官大威，法醫學辭典：化學工業出版社，2009年)。對于木聚糖酶，酶譜技術主要有兩大用途，一是鑒定樣品中是否存在有活性的木聚糖酶，蛋白條帶處于什么位置；二是，樣品中是否存在木聚糖酶的同工酶。目前用于木聚糖酶鑒定的酶譜法，多采用Native-Page與剛果紅染色相結合的方法(Ninave等，Purification and sharacterization of extracellular xylanase from Streptomycescyaneus SN32，Bioresource Technology，2008，99：1252-1258)，但這種方法存在不易著色，操作繁瑣，且需要額外一條Page膠與酶譜膠相對應以確定目的條帶，由于不是同一塊膠，兩塊膠間存在有偏差的風險。

因此，尋找一種簡單易操作的木聚糖酶酶譜鑒定方法，是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法，采用酶譜法，操作及著色簡單，且采用同一塊膠就能夠鑒定出木聚糖酶蛋白條帶及活性。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)制備待測定的木聚糖酶液電泳樣品；

步驟(2)制備分離膠層，再在分離膠上層上制備具有樣品槽的濃縮膠層；

步驟(3)將步驟(2)制備的膠放在垂直電泳槽中并加滿Tris-甘氨酸緩沖液，再在濃縮膠層的樣品槽中點樣后，對所述垂直電泳槽施加電壓，跑膠，直至木聚糖酶液樣品中的溴酚藍條帶跑至垂直電泳槽的底層為止；

步驟(4)利用割膠板將木聚糖酶液樣品所在泳道的膠切成條狀，去除濃縮膠層，保留分離膠層，即獲得包含樣品的條狀分離膠；將所述包含樣品的條狀分離膠，放入乙酸鈉溶液中，孵育；