[發(fā)明專利]一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810853978.0
• 申請(qǐng)日: 2018-07-30
• 公開（公告）號(hào): CN109085230B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙向輝;劉嬋娟;瞿明仁;黎力之;潘珂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/447
• 分類號(hào): G01N27/447
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)制備待測(cè)定的木聚糖酶液樣品；

步驟(2)制備分離膠層，再在分離膠上層上制備具有樣品槽的濃縮膠層；

步驟(3)將步驟(2)制備的膠放在垂直電泳槽中并加滿Tris-甘氨酸緩沖液，再在濃縮膠層的樣品槽中點(diǎn)樣后，對(duì)所述垂直電泳槽施加電壓，跑膠，直至木聚糖酶液樣品中的溴酚藍(lán)條帶跑至垂直電泳槽的底層為止；

步驟(4)利用割膠板將木聚糖酶液樣品所在泳道的膠切成條狀，去除濃縮膠層，保留分離膠層，即獲得包含樣品的條狀分離膠；將所述包含樣品的條狀分離膠，放入乙酸鈉溶液中，孵育20-50分鐘；

步驟(5)將步驟(4)中孵育后的所述包含樣品的條狀分離膠緊密貼在培養(yǎng)皿的底物膠的膠面上，將培養(yǎng)皿放置在30-50℃的生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1-36小時(shí)，直至有清晰的條帶和透明圈出現(xiàn)；所述底物膠由雷馬素亮藍(lán)R交聯(lián)木聚糖、瓊脂粉及pH2.0-8.0的乙酸鈉緩沖液制成；

步驟(1)中所述木聚糖酶液樣品包括木聚糖酶與上樣緩沖液，所述木聚糖酶液的濃度為30-150微克/毫升，所述木聚糖酶液與上樣緩沖液按體積比為1：1-2：1混合；所述上樣緩沖液包括0.5MTris-Hcl緩沖液、甘油、0.5％溴酚藍(lán)及蒸餾水；

所述上樣緩沖液的制備：將1.25毫升0.5MTris-Hcl緩沖液，3毫升甘油，2毫升0.5％溴酚藍(lán)，5.5毫升蒸餾水，混合均勻，即可獲得上樣緩沖液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法，其特征在于，步驟(5)中所述底物膠的制備步驟：稱取10-100毫克雷馬素亮藍(lán)R交聯(lián)木聚糖，0.15-0.6克瓊脂粉，放入30-50毫升pH為2.0-8.0的乙酸鈉緩沖液中，電爐上加熱溶解，冷卻至30-50℃，倒入培養(yǎng)皿中，放置于桌面上，直至冷卻凝固，即獲得底物膠。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法，其特征在于，步驟(2)中的分離膠由蒸餾水、30％丙烯酰胺、1.5MTris-Hcl緩沖液、10％過硫酸銨、四乙基乙二胺原液制成；所述蒸餾水、30％丙烯酰胺、1.5MTris-Hcl緩沖液、10％過硫酸銨、四乙基乙二胺原液的體積比為(1.60-1.70)：(1.8-2.1)：(1.2-1.4)：(0.02-0.07)：(0.003-0.005)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法，其特征在于，步驟(2)中的濃縮膠由蒸餾水、30％丙烯酰胺、0.5MTris-Hcl緩沖液、10％過硫酸銨、四乙基乙二胺原液制成；所述蒸餾水、30％丙烯酰胺、0.5MTris-Hcl緩沖液、10％過硫酸銨、四乙基乙二胺原液的體積比為(2.0-2.2)：(0.4-0.7)：(0.35-0.4)：(0.02-0.04)：(0.002-0.004)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定木聚糖酶蛋白條帶及活性的酶譜方法，其特征在于，步驟(3)中的跑膠步驟為：將步驟(1)中制備的木聚糖酶液樣品，加入到樣品槽中，調(diào)節(jié)電壓為80v，開始跑膠，二十分鐘后，將電壓調(diào)為120v。