[發(fā)明專利]一種群體感應(yīng)淬滅酶ZD03-aiiA基因、其編碼蛋白質(zhì)及其克隆方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810851604.5
• 申請日: 2018-07-30
• 公開（公告）號: CN109022378A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁賢;殷波;張盼
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/10
• 代理公司: 廣州專理知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44493
• 代理人: 譚昉

本發(fā)明涉及一種群體感應(yīng)淬滅酶ZD03?aiiA基因、其編碼蛋白質(zhì)及其克隆方法，利用分子生物學(xué)技術(shù)對ZD03?aiiA基因進行研究，并對其編碼的蛋白功能進行分析，為ZD03?aiiA基因進一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時ZD03菌株作為養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中存在具有抑制細菌群體感應(yīng)活性的微生物，有利于微生物資源開發(fā)，為以致病菌群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶點的新型療法提供新技術(shù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細菌群體感應(yīng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種群體感應(yīng)淬滅酶ZD03-aiiA基因、其編碼蛋白質(zhì)及其克隆方法。

背景技術(shù)

大量研究證明，群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)系統(tǒng)廣泛存在于自然界的許多動植物及微生物中。細菌通過感知細胞外環(huán)境中特定信號分子的濃度變化監(jiān)控自身或其它細菌的數(shù)量變化，啟動相關(guān)基因表達，控制細菌行為適應(yīng)環(huán)境變化。多數(shù)革蘭陰性(G^－)細菌利用酰基高絲氨酸內(nèi)酯(Acyl-homoserine lactone, AHL)作為細菌間的信號分子，革蘭陽性(G^＋)細菌則利用寡肽類(Autoinducing peptide)作為細菌間的介導(dǎo)信號。AHL是一種小分子物質(zhì)，在細菌體內(nèi)由酰基攜帶蛋白酶（ACP）、烯酰基-ACP（enoyl- ACP）還原酶FabΙ及AHL合成酶等參與催化合成。釋放于胞外環(huán)境的AHL被細菌感應(yīng)系統(tǒng)識別，與蛋白結(jié)合成具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的二聚或多聚體，激活目的基因表達，調(diào)控Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、抗生素靈菌紅素（prodigiosin）合成、毒力基因表達及生物膜形成等。蛋白質(zhì)組學(xué)及DNA核酸微點陣技術(shù)的應(yīng)用結(jié)果也表明:通過信號介導(dǎo)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄子活性而激活毒力基因表達，實現(xiàn)不同的調(diào)節(jié)功能。通過干擾致病菌QS系統(tǒng)，使其信號分子在細胞環(huán)境中的濃度難以被致病菌感應(yīng)系統(tǒng)感知而抑制致病因子表達，達到防治病原菌目的。

本發(fā)明從養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中分離純化菌株ZD03，以根癌農(nóng)桿菌W CF47為敏感檢測菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZD03具有細菌群體感應(yīng)淬滅活性，在寡營養(yǎng)狀態(tài)下可形成芽孢，具有耐熱穩(wěn)定性。結(jié)合菌落形態(tài)、生化特征及16S rDNA序列對比分析表明，該菌株為枯草芽孢桿菌。表明養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中存在具有抑制細菌群體感應(yīng)活性的微生物，有利于微生物資源開發(fā)，為以致病菌群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶點的新型療法提供新技術(shù)。

將淬滅酶基因ZD03-aiiA進行克隆及序列分析，結(jié)果表明：陽性克隆ZD03-aiiA基因序列全長753 bp，存在一個開放閱讀框(ORF)，編碼由250個氨基酸殘基組成的多肽，預(yù)測分子量28.1KDa，蛋白等電點為4.78。由該序列推導(dǎo)得到的氨基酸殘基序列含有一個保守結(jié)構(gòu)域(Lactamase-B) (34AA -235AA)。該結(jié)果為該序列的重組表達及其相關(guān)活性研究奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種群體感應(yīng)淬滅酶ZD03-aiiA基因；本發(fā)明的另一個目的是提供一種群體感應(yīng)淬滅酶ZD03-aiiA基因編碼的蛋白質(zhì)；同時本發(fā)明還提供一種群體感應(yīng)淬滅酶ZD03-aiiA基因的克隆方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一個方面是提供一種群體感應(yīng)淬滅酶ZD03-aiiA基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

本發(fā)明的第二個方面是提供本發(fā)明第一各方面所述的一種群體感應(yīng)淬滅酶ZD03-aiiA基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2。

本發(fā)明的第三個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的一種群體感應(yīng)淬滅酶ZD03-aiiA基因的克隆方法，包括以下步驟：

（1）ZD03-aiiA基因的簡并引物設(shè)計，其簡并引物對為，

aiiF：SEQ ID NO:3 5′-ATG GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT TAT-3；