[發明專利]一種Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的驗證方法

在審

• 申請號: 201810849163.5
• 申請日: 2018-07-28
• 公開（公告）號: CN109022546A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 張亞妮;張文慧;李碧春;王穎潔;王曼
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/66;G01N33/68
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞;董建林

本發明公開了一種Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的驗證方法：首先，對Nanos2 5’側翼區序列進行PCR擴增，構建真核表達載體pNanos2?EGFP，將pNanos2?EGFP、pEGFP?N1、pLinker?EGFP分別轉染DF?1細胞，以對Nanos2啟動子區定性分析；分別構建啟動子5’端不同長度缺失載體pGL3?1187、pGL3?959、pGL3?788、pGL3?493、pGL3?155與pRL?SV40共轉染DF?1細胞，進行雙熒光素酶報告基因檢測以對Nanos2啟動子核心區域進行鑒定，構建缺失核心區域載體，再次進行雙熒光素酶活性分析，觀察是否缺失核心區域后啟動子活性喪失或顯著降低；對Nanos2啟動子核心區域進行轉錄因子結合位點預測，進行雙熒光素酶報告分析和CHIP試驗確定關鍵轉錄因子。通過細胞形態學觀察、qRT?PCR、細胞免疫化學、流式細胞分析等方法檢測雄性生殖細胞分化情況。

技術領域

本發明屬于動物育種學和細胞生物學領域，具體涉及一種Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的驗證方法。

背景技術

胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類全能性干細胞，具有分化為機體各類細胞的潛能，而其向雄性生殖細胞的分化一直是當前的研究熱點之一。眾所周知，ESCs向雄性生殖細胞的分化過程中受到誘導因子、關鍵基因和信號通路等因素的協同調控，因此只有分別闡明這些調控因素在雄性生殖細胞分化中的調節機制，建立有效的體外誘導分化體系，才有從根本上有效提高雄性生殖細胞的體外生成效率。

Nanos2是一個高度特異決定性別分化的內源性雄性生殖基因，對PGCs和SSCs的自我更新與維持具有重要的調控作用。盡管Nanos2在奶山羊、牦牛和犏牛等物種的不同組織中表達有差異，但其均在睪丸中呈現較高的表達量；已有研究表明，Nanos2與精細胞的形成及減數分裂有關，可抑制減數分裂起始基因Stra8的表達。本實驗室前期研究發現，體外過量表達Nanos2可促進雞ESCs向PGCs和SSCs生成，而其缺失則可導致性腺發育受阻從而制約雄性生殖細胞的生成。那么，Nanos2的表達受到哪些因素的調控進而影響了雄性生殖細胞的生成過程需要進一步探究。

鳥類有別于哺乳動物的生殖方式是本方法成功應用的前提:鑒于雞獨特的胚胎發育過程，可從囊胚中獲得大量的ESCs，極大滿足了人類研究和生產實踐的需要。但因體外ESCs轉染效率不穩定，導致誘導效果不穩定，還需進一步完善該誘導體系。ESCs對轉染試劑較為敏感，導致轉染效率不穩定。

發明內容

為了克服上述缺陷，本發明提供一種Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的驗證方法，采用本方法，能夠實現Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的篩選，并在體外水平進行了驗證。

為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：一種Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的驗證方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)Nanos2啟動子區域活性定性檢測

對Nanos2基因5’側翼區-2bp～-1189bp進行PCR擴增，擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，構建到經AseⅠ、KpnⅠ雙酶切后的pEGFP-N1載體中，重組質粒pNanos2-EGFP經單、雙酶切、菌液PCR鑒定后，陽性樣品送測，核酸測序比對后表明重組載體構建成功；

將pNanos2-EGFP、pEGFP-N1、pLinker-EGFP分別轉染DF-1細胞，轉染24h后，熒光倒置顯微鏡下觀察，以對啟動子活性區域進行定性檢測；

(2)Nanos2啟動子核心區域鑒定