[發明專利]一種Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的驗證方法

在審

• 申請號: 201810849163.5
• 申請日: 2018-07-28
• 公開（公告）號: CN109022546A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 張亞妮;張文慧;李碧春;王穎潔;王曼
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/66;G01N33/68
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞;董建林

1.一種Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的驗證方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）Nanos2啟動子區域活性定性檢測

對Nanos2基因5’側翼區-2bp~-1189bp進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，構建到經AseⅠ、KpnⅠ雙酶切后的pEGFP-N1載體中，重組質粒pNanos2-EGFP經單、雙酶切、菌液PCR鑒定后，陽性樣品送測，核酸測序比對后表明重組載體構建成功；

將pNanos2-EGFP、pEGFP-N1分別轉染DF-1細胞，轉染24h后，熒光倒置顯微鏡下觀察，以對啟動子活性區域進行定性檢測；

（2）Nanos2啟動子核心區域鑒定

通過PCR方法擴增出了Nanos2啟動子5’端不同長度缺失片段1187bp、959bp、788bp、493bp、155bp，構建啟動子系列缺失載體；系列缺失載體經Sma I、Kpn I雙酶切、菌液PCR鑒定后，陽性樣品送測，載體構建成功后分別命名為pGL3-1187、pGL3-959、pGL3-788、pGL3-493、pGL3-155；

將啟動子系列缺失載體分別與pRL-SV40共轉染DF-1細胞，同時轉染pGL3-basic組作為陰性對照，進行雙熒光素酶報告分析檢測各啟動子缺失片段活性，以期篩選到核心區域，為了進一步驗證核心區域，構建缺失核心區域載體，再次進行雙熒光素酶活性分析，觀察是否缺失核心區域后啟動子活性喪失或顯著降低；

（3）Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的確定

對Nanos2啟動子核心區域進行轉錄因子結合位點預測，通過篩選，預測-157~-495bp之間存在重要轉錄因子結合位點FoxD3、Nobox；利用同源重組技術，分別構建FoxD3、Nobox候選轉錄因子結合位點缺失載體，經測序，結果與預期一致，表明載體構建成功，將成功構建的缺失載體分別命名為pGL3/493- FoxD3、pGL3/493- Nobox，分別與pRL-SV40共轉染DF-1細胞，設置pGL3/493組為陽性對照，pGL3-basic組為陰性對照，進行雙熒光素酶報告分析和CHIP試驗，以確定關鍵轉錄因子；

（4）關鍵轉錄因子調控作用體外驗證

分別構建關鍵轉錄因子結合位點缺失和過表達載體，在無飼養層RA誘導體系下進行體外驗證；通過細胞形態觀察、熒光定量檢測、間接免疫熒光檢測、流式細胞分析的方法對雄性生殖細胞的生成進行檢測。

2.根據權利要求1所述的一種Nanos2啟動子核心區域關鍵轉錄因子的驗證方法，其特征在于：還包括如下步驟：（5）雙熒光素酶報告基因檢測：將包含不同啟動子片段的重組質粒和pRL-SV40以30:1的比例共轉染DF-1細胞，同時以30:1的比例共轉染質粒PGL3-Basic空載體和pRL-SV40作為陰性對照；轉染24小時后，去掉DF-1細胞培養基，PBS清洗，加入胰酶消化1min小心吸去胰酶，加入PBS吹打至細胞全部脫落，收集細胞，1200r/min離心6min，棄掉上清，每個孔的細胞最終用70μl Passive Lysis Buffer 1×裂解液懸浮細胞，移入96孔不透明圓底酶標板中,每孔加入70μl Luciferase Assay Substrate，吹勻，放入酶標儀中讀取螢火蟲熒光值，加入70μl STOP終止液，吹勻，再放入酶標儀中讀取海腎熒光值，最后計算螢火蟲熒光值/海腎熒光值的相對熒光活性。