[發明專利]一種酚氧化酶活性蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201810845552.0
• 申請日: 2018-07-27
• 公開（公告）號: CN108998427B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 康信煌;鄧春梅;洪鵬志;何蘭珍;張國光
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 李慧

本發明公開了一種酚氧化酶活性蛋白的制備方法。本發明是以制備鱟試劑殘留的廢血漿為原料，通過飽和硫酸銨溶液鹽析蛋白質，冷凍離心得鱟血藍蛋白，再將血藍蛋白的PBS溶液通過MW3500Da透析袋透析除鹽，經SephacrylS?100丙烯葡聚糖凝膠柱純化、濃縮處理獲得高效酚氧化酶活性血藍蛋白，其反應初速度Vi=74.52 nmol·（min·mg）。本發明獲得的產品純度、活性高，可以用于制備高效，簡便，成本低的酚類污染物的微型檢測器；本發明制備方法簡單，采用MW3500Da透析袋和SephacrylS?100丙烯葡聚糖凝膠柱相配合的方式可同時達到脫鹽、分離、純化和濃縮的效果。

技術領域

本發明涉及一種活性蛋白的制備方法，具體是一種酚氧化酶活性蛋白的制備方法，屬于天然活性物質提取技術領域。

背景技術

酚類主要包括苯酚、甲酚、氨基酚、二硝基鄰甲酚、荼酸和五氯酚等，酚主要來源于煉焦、煉油、制造煤氣、酚、絕緣材料、藥、造紙等生產過程中排出的廢氣和廢水。酚是一種中等強度的化學毒物，是惡臭物質，可經消化道、呼吸道和皮膚粘膜侵入人體，與細胞原生質中的蛋白結合，使細胞失去活力；同時，酚還對神經、泌尿、消化系統有毒害作用，低濃度可引起蓄積性慢性中毒，高濃度可引起急性中毒以致昏迷死亡。酚被列入美國環境保護署（EPA）公布的水環境中129種優先控制污染物之一，具有長效性和生物積累性，即使在低濃度下也是有毒的，不僅會對水生生物造成很大傷害，而且會對人類造成幾種全身性疾病。

酚類污染是指酚類對環境造成的污染。由于酚的用途極為廣泛，謹防酚的外瀉，預防其污染的工作很困難。目前，酚類化合物的檢測和測定方法主要有：色譜分析法﹑光譜分析法﹑免疫分析法和電化學分析法。色譜法和光譜法以其準確度高靈敏度高等優點成為酚類物質的主要檢測方法，但其設備復雜昂貴。免疫分析法減少了樣品前處理步驟，可實現高通量篩選，成本低等優點。電化學分析法可以用于連續，自動及其遙控測定具有靈敏度高，選擇性好，設備簡單，操作方便等優點受到越來越多的關注。

酚氧化酶是一種化學物質，是在分子氧存在下，能把酚類氧化成鄰苯醌，或對苯醌的酶。現有技術中，利用多酚氧化酶制備生物酶傳感器用于檢測廢水中的酚類。隨著檢測技術的發展，快速簡單有效的測定方法將是今后酚類污染物檢測技術的重要發展趨勢。

酚氧化酶幾乎存在于所有的機體中，執行一些重要的生物功能，例如，它對植物和節肢動物體內黑色素的合成、皮膚和毛發色素的沉淀、果實的著色和傷口的愈合有促進作用。研究證實，血藍蛋白在物理化學性質﹑基因序列和蛋白質結構上和酚氧化酶非常相似。

血藍蛋白又稱血藍素，是一種多功能蛋白，一般認為，血藍蛋白的主要生物學功能與機體內的輸氧有關，它與血紅蛋白和蚯蚓血紅蛋白并稱為動物界的三種呼吸蛋白。但近年來的一些研究表明，血藍蛋白是一種多功能蛋白，它不僅具有輸氧功能，而且還和能量的儲存，滲透壓的維持以及蛻皮過程的調節有關。特別引起學術界的重視的是，血藍蛋白還具有酚氧化酶活性、抗菌活性、抗腫瘤活性、凝集活性等多種非特異性免疫學活性，被認為是節肢動物和軟體動物中的一種重要的免疫分子。

近幾年人們發現血藍蛋白在一定的條件下也可以表現出來酚氧化酶的活性。嚴芳等發現凡納濱對蝦血藍蛋白在胰蛋白酶誘導下可表現出酚氧化酶的活性，其活性會被不同的糖所抑制；而陳鋒菊等發現鋸緣青蟹血藍蛋白在沒有任何誘導物的情況下表現出酚氧化酶活性，Ca²⁺和Cu²⁺能使血藍蛋白的酚氧化酶有顯著增強。現有很多研究報道了酚氧化酶的體內和體外的激活機制，也有部分學者嘗試用不同的激活劑來激活血藍蛋白的酚氧化酶活性，比如鹽，尿素，醇，金屬離子等，其中，十二烷基磺酸鈉（SDS）是應用得最多的一個激活劑；研究者們發現淡水小龍蝦、日本帝王蟹、黃道蟹等的血藍蛋白既可在胰蛋白酶又可在SDS誘導下表現出酚氧化酶活性；Siddiqui等還證實了螺旋狀的β-血藍蛋白及亞基或功能單位在蛋白酶或SDS的誘導下均可表現出不同程度的酚氧化酶活性。血藍蛋白在一定條件下可以向結構相似的酚氧化酶發生轉變，這說明了血藍蛋白是節肢動物和軟體動物中的一種相當重要的潛在的免疫分子。

發明內容