[發(fā)明專利]基于iTRAQ技術的胎膜早破孕婦陰道分泌物差異蛋白的篩選方法

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• 申請日: 2018-07-27
• 公開（公告）號: CN109142565A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發(fā)明（設計）人: 王建東
• 申請（專利權）人: 重慶早柒天生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.基于iTRAQ技術的胎膜早破孕婦陰道分泌物差異蛋白的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、制定BSA標準品的標準曲線，并采用Bradford法測定樣品蛋白質濃度；

S2、取樣品加入蛋白酶酶解，對酶解得到的肽段進行iTRAQ標記；

S3、分離標記后的肽段，并進行質譜分析；

S4、對肽段進行分析并與國際人類蛋白數據庫進行比對鑒定，篩選出差異大于1.3倍的差異蛋白。

2.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于：對S4中的差異蛋白進一步進行生物信息學分析，利用DAVID數據庫對差異蛋白進行細胞成分、分子功能和生物學進程聚類分析，進一步篩選出高差異性的差異蛋白。

3.根據權利要求1或2所述的篩選方法，其特征在于，S1的具體步驟為：制定BSA標準品的標準曲線，準備0、2、4、6、8、10、12、14、16、18μl的標準品(0.2μg/μl BSA)，然后添加PBS至最終體積為20μl。將0μl作為空白對照，然后把樣品稀釋至測量范圍內，每個樣品各取20μl至管中。再分別加入180μl的蛋白測試試劑，混勻后置于37℃30min。然后在595nm下用酶標儀測定其吸光度，根據標準曲線計算出樣品濃度。

4.根據權利要求1或2所述的篩選方法，其特征在于，S2中的酶解具體步驟為：各取100微克濃縮樣本溶解于20μl 8MUrea溶液，5mM TCEP還原1小時，半光氨酸阻斷10分鐘，加入三倍體積pH 8.5TEAB buffer，胰蛋白酶37℃酶解過夜。

5.根據權利要求4所述的篩選方法，其特征在于，S2中的iTRAQ標記具體步驟為：胰蛋白酶酶解消化后，用真空離心泵抽干肽段，接著用0.5mol的TEAB復溶肽段，然后對肽段進行iTRAQ標記，115和119、113和117分別定量標記實驗組和對照組的蛋白，置于室溫下培養(yǎng)2小時，標記樣本加入同一試管，C18萃取柱脫鹽，真空冷凍干。

6.根據權利要求1或2所述的篩選方法，其特征在于，S3中分離的具體步驟為：第一維強陽離子柱分離：在高效液相色譜儀中將標記好的樣品加到強陽性離子交換柱，混合樣品先經過A相緩沖液重新溶解上樣，所述A相緩沖液pH為2.6，并含有10mmol/L的KH₂PO₄以及25％的乙腈；再經B相緩沖液以0～80％的濃度梯度、200μl/min流速洗脫60min，所述A相緩沖液pH為2.6，并含有10mmol/L的KH₂PO₄、25％乙腈和350mmol/L的KCl；根據峰型和時間共收取20個梯度，紫外檢測波長設置：214nm/280nm；第二維反相液質聯(lián)用質譜分析：收集的20個梯度真空離心濃縮后，用50μl PRLC A相高效液相緩沖液溶解，A相高效液相緩沖液含有5％乙腈和0.1％甲酸；經過填充Zorbax300SB-C18的反相色譜柱富集；再經B相高效液相緩沖液以5％～35％的濃度梯度、300nl/min流速洗脫90min，B相高效液相緩沖液含有95％乙腈和0.1％甲酸。

7.根據權利要求6所述的篩選方法，其特征在于，S3中質譜分析的具體步驟為：洗脫下的樣品，通過電噴霧源直接進入Q-star質譜儀，進行一級質譜和串聯(lián)質譜分析；質譜分析設定標準：MS掃描范圍400～1800；MS/MS掃描100～2000；IDA采集模式：一個圖譜選擇四個最強的母離子進行串級掃描。

8.一種權利要求1～7任一權利要求所述篩選方法篩選得到的胎膜早破孕婦陰道分泌物差異蛋白，其特征在于，為IGFBP-1、AFP、PRL或LZM。

9.權利要求8所述的差異蛋白作為生物標志物在制備診斷胎膜的產品中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的差異蛋白為AFP或IGFBP-1。