[發明專利]一種基于數字PCR的有機磷農藥殘留生物條形碼免疫分析試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201810835965.0
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108866166B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 金茂俊;王靜;崔雪妍;金芬;邵華;佘永新;鄭鷺飛;王珊珊;王淼;曹振
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;G01N33/577
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了一種基于數字PCR的有機磷農藥殘留生物條形碼免疫分析試劑盒，屬于農藥檢測技術領域。所述試劑盒包括如下組成：膠體金探針溶液、磁性納米探針溶液、磁分離裝置、洗液、微滴發生器、PCR引物對、PCR探針和PCR Mix液；所述膠體金探針為表面修飾有生物條形碼和特異性單克隆抗體的金納米粒子；所述生物條形碼利用所述PCR引物對擴增得到；所述PCR探針的核苷酸序列與所述生物條形碼的部分序列互補配對；所述磁性納米探針為表面修飾有機磷農藥抗原的磁球。本發明提供的試劑盒利用生物條形碼進行信號放大，同時利用數字PCR絕對定量，能顯著提高檢測靈敏度。

技術領域

本發明屬于農藥檢測技術領域，具體涉及一種基于數字PCR的有機磷農藥殘留生物條形碼免疫分析試劑盒及其應用。

背景技術

三唑磷農藥是一種光譜性的有機磷殺蟲劑，殺螨劑。三唑磷農藥已在2016年12月31日禁止在蔬菜中使用，并且日本規定稻米中三唑磷的最大殘留限量(MRL)為不得檢出；歐盟除茶葉為0.05mg/kg、棉籽0.1mg/kg外，其余樣品為0.02mg/kg；我國三唑磷的最大殘留限量一般都限定為0.05mg/kg。因此加強對于三唑磷的殘留檢測方法具有重要意義。

相對于GC-MS/MS，LC-MS/MS，GC等方法來說，免疫分析方法具有快速簡便，不需要專門的技術人員，價格成本低等優點，免疫分析方法主要包括熒光免疫分析，酶聯免疫分析，化學發光免疫分析，生物條形碼免疫分析。生物條形碼免疫分析方法以其高靈敏度在近幾年迅速發展。數字PCR技術是一種可以對待檢物進行絕對定量分析的技術。在1992年，Sykes等在正常體細胞和非淋巴細胞背景下檢測白血病細胞時提出要將體系進行有限稀釋，終點信號的有無，根據泊松分布的原理處理數據。在當時并沒有提出數字PCR的概念，但是卻為數字PCR的產生奠定了基礎。在1999年，Vogelstein等正式提出了數字PCR的概念。DeborahPersaud等利用微滴式數字PCR技術確認全球首例HIV感染患兒功能性治愈馮兆民等基于微滴式數字PCR技術對甲型流感病毒進行檢測。數字PCR以及廣泛應用于基因表達分析，臨床診斷，轉基因成分定量，微生物檢測等方面的應用，現階段還沒有關于農藥等小分子物質的檢測。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于數字PCR的有機磷農藥殘留生物條形碼免疫分析試劑盒及其應用，提高檢測靈敏度。

本發明提供了一種基于數字PCR的有機磷農藥殘留生物條形碼免疫分析試劑盒，所述試劑盒包括如下組成：膠體金探針溶液、磁性納米探針溶液、磁分離裝置、洗液、微滴發生器、PCR引物對、PCR探針和PCR Mix液；所述膠體金探針為表面修飾有生物條形碼和特異性單克隆抗體的金納米粒子；所述生物條形碼利用所述PCR引物對擴增得到；所述PCR探針的核苷酸序列與所述生物條形碼的部分序列互補配對；所述磁性納米探針為表面修飾有機磷農藥抗原的磁球。

優選的，生物條形碼的修飾方法通過固定在金納米粒子表面的生物條形碼互補鏈互補配對實現。

優選的，所述生物條形碼的序列如SEQ ID No.1所示；所述PCR引物對包括擴上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述下游引物的序列如SEQ IDNo.3所示；所述PCR探針的序列如SEQ ID No.4所示。

優選的，所述膠體金探針溶液中特異性單克隆抗體的濃度為40～50mg/L；所述膠體金探針溶液中生物條形碼的濃度為1～3μmol/L；所述磁性納米探針溶液中抗原的濃度為70～80mg/L；

優選的，所述有機磷農藥包括三唑磷，所述有機磷農藥抗原包括三唑磷半抗原與OVA偶聯形成的完全抗原，所述特異性單克隆抗體包括抗三唑磷單克隆抗體。

優選的，所述金納米粒子的粒徑≤0.22μm；所述洗液為0.005～0.015mol/L的pH值為7～8的PBS緩沖液。

優選的，所述試劑盒中還包括有機磷農藥標準品。