[發明專利]一種基于數字PCR的有機磷農藥殘留生物條形碼免疫分析試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201810835965.0
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108866166B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 金茂俊;王靜;崔雪妍;金芬;邵華;佘永新;鄭鷺飛;王珊珊;王淼;曹振
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;G01N33/577
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種基于數字PCR的有機磷農藥殘留生物條形碼免疫分析試劑盒，其特征在于，由如下物質組成：膠體金探針溶液、磁性納米探針溶液、磁分離裝置、洗液、微滴發生器、PCR引物對、PCR探針和PCRMix液；所述膠體金探針為表面修飾有生物條形碼和特異性單克隆抗體的金納米粒子，制備膠體金探針時的封閉時間為30min；所述生物條形碼利用所述PCR引物對擴增得到；所述PCR探針的核苷酸序列與所述生物條形碼的部分序列互補配對；所述磁性納米探針為表面修飾有機磷農藥抗原的磁球，磁性顆粒與半抗原-OVA的偶聯物的封閉時間為40min；

所述有機磷農藥為三唑磷，所述有機磷農藥抗原為三唑磷半抗原與OVA偶聯形成的完全抗原，所述特異性單克隆抗體為抗三唑磷單克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，生物條形碼的修飾方法通過固定在金納米粒子表面的生物條形碼互補鏈互補配對實現。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述生物條形碼的序列如SEQ ID No.1所示；所述PCR引物對包括擴上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.3所示；所述PCR探針的序列如SEQ ID No.4所示。

4.根據權利要求1～3任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述膠體金探針溶液中特異性單克隆抗體的濃度為40～50mg/L；所述膠體金探針溶液中生物條形碼的濃度為1～3μmol/L；所述磁性納米探針溶液中抗原的濃度為70～80mg/L。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述金納米粒子的粒徑≤0.22μm；所述洗液為0.005～0.015mol/L的pH值為7～8的PBS緩沖液。

6.根據權利要求1或5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括有機磷農藥標準品。

7.權利要求1～6任一項所述試劑盒在檢測有機磷農藥殘留中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述檢測有機磷農藥殘留的方法包括如下步驟：

(1)將膠體金探針溶液與待測樣品和磁性納米探針溶液混合，37℃孵育0.5～2h，得到反應液；

(2)將反應液用磁分離裝置吸附后，棄去溶液，用洗液進行洗滌，得到磁性納米探針和膠體金探針的復合物；

(3)將所述步驟(2)得到的磁性納米探針和膠體金探針的復合物置于50～65℃水中震蕩解離0.5～2h，得到生物條形碼溶液；

(4)以所述步驟(3)中得到的生物條形碼溶液為擴增模板，用PCR引物對和PCRMix液配制PCR反應體系；

(5)將所述PCR反應體系利用微滴發生器進行數字PCR擴增，得到生物條形碼的絕對定量結果；

(6)以有機磷農藥標準品為待測樣品，按步驟(1)～(5)的方法測定絕對定量結果，將有機磷農藥標準品濃度的log值與抑制率繪制成標準曲線，計算得到標準方程式；

(7)將所述步驟(5)得到的生物條形碼量絕對定量計算得到的抑制率代入標準方程式中，計算得到有機磷農藥殘留量；

所述步驟(6)和步驟(1)～(5)之間沒有時間順序的限制。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述步驟(4)中PCR反應體系包括10μL的PCR Mix液，2μL模板，1μL 200～300nmol/L的上游引物，1μL 200～300nmol/L的下游引物，0.5μL 100～150nmol/L的PCR探針和5.5μL的ddH₂O；所述步驟(5)中數字PCR擴增的反應程序為：95℃，8:00；94℃，30s，57℃，40s，40個循環；98℃，8:00；4℃hold。