[發明專利]提升大腸桿菌角鯊烯含量用質粒pCDAF及其制備和使用方法

在審

• 申請號: 201810835330.0
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108866089A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 徐文;姚佳;馬茜;李薇;孫曉敬;汪洋
• 申請（專利權）人: 西安醫學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 羅笛

本發明公開了一種提升大腸桿菌中角鯊烯含量的方法，具體通過增生大腸桿菌的內膜進行，本發明還公開了一種質粒pCDAF，通過大量表達ATP合酶b亞基基因atpF促使大腸桿菌內膜增生，本發明還公開了該質粒pCDAF的制備和使用方法。本發明的技術方案，通過表達ATP合酶b亞基基因atpF促使細胞內膜增生使角鯊烯及其合成前體物的儲存空間增加，最終提高角鯊烯的積累量，通過質粒pCDAF用于促使大腸桿菌中內膜的增生，含有鏈霉素抗性基因作為篩選標記，以強啟動子PT7控制ATP合酶b亞基基因atpF的表達以提高其表達量。

技術領域

本發明屬于生物基因工程領域，特別是涉及一種提升大腸桿菌角鯊烯含量的方法，還涉及一種提升大腸桿菌角鯊烯含量用質粒pCDAF，還涉及一種該pCDAF的制備方法，還涉及一種該質粒pCDAF的使用方法。

背景技術

角鯊烯是一種天然存在于多種微生物及動植物細胞內的三萜烯類化合物，具有抗氧化，保護心臟，提高免疫力，降低血脂及抑制癌癥發展等多種功效，已被廣泛應用于醫藥及保健品領域。當前，市面上的角鯊烯主要來源于植物種子及動物肝臟的提取，因此價格比較昂貴，另外通過提取的方法獲得還具有周期長、成本高、破壞環境等缺點，因此，亟需新的更環保、更廉價的生產方式。

微生物發酵生產活性化合物具有廉價、快速、環保等優點。近年來，諸多研究致力于利用酵母、微藻及沼澤紅假單胞菌等微生物進行角鯊烯的發酵生產，但均未實現突破，其產量與工業化生產要求尚有較大差距。究其原因，角鯊烯含量低或發酵密度低等因素限制了角鯊烯的最終產量。

大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)作為模式菌，具有研究透徹、易改造、易培養等特點，是發酵生產活性化合物的理想菌之一。目前，通過大腸桿菌已經生產出青蒿素、類胡蘿卜素等多種活性物質。然而，大腸桿菌由于缺乏角鯊烯合酶，不能天然合成角鯊烯。前期申請人通過引入外源角鯊烯合酶成功構建大腸桿菌E.coli CSQ1使其能夠合成角鯊烯，然而大腸桿菌E.coli CSQ1中角鯊烯的含量較低，離工業化生產要求尚有較大差距。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種提升大腸桿菌中角鯊烯含量的方法，通過大腸桿菌內膜增生來提高角鯊烯及其合成前體物的貯存空間，以此提高細胞內角鯊烯的積累量。

本發明的第二個目的是提供一種質粒pCDAF，通過大量表達ATP合酶b亞基基因atpF促使大腸桿菌內膜增生。

本發明的第三個目的是提供一種該質粒pCDAF的制備方法，用于制備質粒pCDAF。

本發明的第四個目的是提供一種利用pCDAF提高大腸桿菌中角鯊烯含量的方法，用以實現如何使用該質粒pCDAF促使大腸桿菌合成角鯊烯。

為了達到上述第一個目的，本發明所采用的第一種技術方案是，一種提升大腸桿菌中角鯊烯含量的方法，通過增生大腸桿菌的內膜進行；所述大腸桿菌為可合成角鯊烯的大腸桿菌E.coli CSQ1，所述大腸桿菌E.coli CSQ1是先通過將野生菌株E.coli C43(DE3)制備成氯化鈣感受態細胞后，再通過熱擊法轉化質粒pTsqs，最后利用氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR驗證獲得的，所述質粒pTsqs的核苷酸序列表如序列1所示。

為了達到上述第二個目的，本發明所采用的第二個技術方案是，一種質粒pCDAF，用于增生權利要求1所述大腸桿菌的內膜，包括載體pCDFDuet-1，載體pCDFDuet-1內插入有阻礙蛋白表達基因lacI、大腸桿菌復制起始位點CDF ori、鏈霉素抗性基因和ATP合酶b亞基基因atpF，ATP合酶b亞基基因atpF上游具有PT7啟動子以啟動ATP合酶b亞基基因atpF的表達；所述質粒pCDAF的核苷酸序列如序列2所示。

為了達到上述第三個目的，本發明所采用的第三種技術方案是，一種質粒pCDAF的制備方法，具體按照以下步驟實施：