[發明專利]提升大腸桿菌角鯊烯含量用質粒pCDAF及其制備和使用方法

在審

• 申請號: 201810835330.0
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108866089A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 徐文;姚佳;馬茜;李薇;孫曉敬;汪洋
• 申請（專利權）人: 西安醫學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 羅笛

1.一種提升大腸桿菌中角鯊烯含量的方法，其特征在于，通過增生大腸桿菌的內膜進行；所述大腸桿菌為可合成角鯊烯的大腸桿菌E.coli CSQ1，所述大腸桿菌E.coli CSQ1是先通過將野生菌株E.coli C43(DE3)制備成氯化鈣感受態細胞后，再通過熱擊法轉化質粒pTsqs，最后利用氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR驗證獲得的，所述質粒pTsqs的核苷酸序列表如序列1所示。

2.一種質粒pCDAF，用于權利要求1所述大腸桿菌的內膜增生，其特征在于，包括載體pCDFDuet-1，載體pCDFDuet-1內插入有阻礙蛋白表達基因lacI、大腸桿菌復制起始位點CDFori、鏈霉素抗性基因和ATP合酶b亞基基因atpF，ATP合酶b亞基基因atpF上游具有PT7啟動子以啟動ATP合酶b亞基基因atpF的表達；所述質粒pCDAF的核苷酸序列如序列2所示。

3.一種權利要求2所述質粒pCDAF的制備方法，其特征在于，具體按照以下步驟實施：

步驟1，先依據大腸桿菌E.coli CSQ1的基因atpF設計一對引物，之后以基因組為模板通過菌落PCR獲得上下游分別含有NdeI與KpnI酶切位點的基因atpF，基因atpF的核苷酸序列表如序列3所示；

步驟2，先后通過酶切和連接方法將將步驟1得到的基因atpF插入載體pCDFDuet-1的NdeI與KpnI酶切位點之間，構建得到質粒pCDAF；

步驟3，利用菌落PCR與雙酶切方法對質粒pCDAF進行驗證。

4.根據權利要求3所述的質粒pCDAF的制備方法，其特征在于，在所述步驟1中，所述一對引物如下：

atpF_F_NdeI：5’-GGAATTCCATATGGTGAATCTTAACGCAACAATC-3’

atpF_R_KpnI：5’-CGGGTACCTTACAGTTCAGCGACAAGTT-3’

以基因組為模板，采用atpF_F_NdeI與atpF_R_KpnI引物擴增atpF基因即為上下游分別含有NdeI與KpnI酶切位點的基因atpF。

5.根據權利要求4所述的質粒pCDAF的制備方法，其特征在于，在所述步驟2中，采用NcoI與EcoRI兩種限制性內切酶分別對基因atpF和載體pCDFDuet-1分別進行雙酶切，然后利用T4鏈接酶將兩者進行連接，最終得到質粒pCDAF。

6.一種利用權利要求2中所述質粒pCDAF提高大腸桿菌中角鯊烯含量的方法，其特征在于，具體按照以下步驟實施：

步驟1，先將大腸桿菌E.coli CSQ1制備成氯化鈣感受態細胞，然后通過熱擊法將質粒pCDAF轉入E.coli CSQ1，最后利用氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR驗證獲得重組菌E.coliCSAF1；

步驟2，驗證重組菌E.coli CSAF1中內膜增生；

步驟3，驗證重組菌E.coli CSAF1中角鯊烯的合成。

7.根據權利要求6所述的利用質粒pCDAF提高大腸桿菌中角鯊烯含量的方法，其特征在于，在步驟2的驗證具體為：先采用LB液體培養基培養步驟1得到的重組菌E.coli CSAF1，并加入誘導劑IPTG誘導基因atpF表達，之后離心收集菌體，冷凍干燥過夜，最后通過電子掃面顯微鏡觀察細胞內膜變化。

8.根據權利要求6所述的利用質粒pCDAF提高大腸桿菌中角鯊烯含量的方法，其特征在于，在步驟3的驗證具體為：先通過皂化法分離、提取合成的角鯊烯；再通過高效液相色譜法檢測該角鯊烯。