[發明專利]一種酶活提高的雙果糖酐水解酶突變體C387A

有效

• 申請號: 201810834320.5
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108949723B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 沐萬孟;江波;郁書懷;張濤;朱鶯鶯;程園園
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/12
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種酶活提高的雙果糖酐水解酶突變體C387A，屬于基因工程技術領域。首先我們對來源于微生物Arthrobacter chlorophenolicus A6的雙果糖酐水解酶(AcDFA?IIIase)做了鑒定，并以此酶作為親本，利用基因突變技術，將其387位的半胱氨酸Cys替換成丙氨酸Ala，獲得單點突變體酶C387A，在最適催化條件下(pH 6.5，55℃)催化底物雙果糖酐合成菊二糖的比酶活提高了85.2％，催化效率提高了2倍。這一發現對于工業化制備菊二糖具有重要的研究價值，為進一步工業應用雙果糖酐水解酶提供了有利保障。

技術領域

本發明涉及一種酶活提高的雙果糖酐水解酶(AcDFA-IIIase)突變體C387A，屬于基因工程技術領域。

背景技術

果聚糖(fructan)是一種主要由果糖基連接成的碳水化合物的總稱，自然界中普遍存在，其分布就像葡聚糖(gluctan)比如淀粉一樣廣泛。其中，有一種果聚糖分子，其末端是一分子的葡萄糖，因此這種果聚糖整體不顯示還原性。果聚糖廣泛存在于自然界中：其不僅存在于大約15％的開花植物中，也大量存在于微生物包括細菌和真菌中。果聚糖可以提高植物的耐旱能力，還可以起到液泡滲透緩沖劑和低溫保護劑的作用。這主要是由于植物中的果聚糖主要分布在細胞液泡中，起到了調節滲透壓的作用。細菌果聚糖它可以保護細胞和防止失水。

由于果糖基連接位置的不同以及物種間聚合度的差異，果聚糖的結構相當復雜。自然界中主要存在兩大類：

(1)菊糖：主要以β-(2,1)鍵連接，這一類型的果聚糖主要存在于雙子葉植物中。菊糖的生產主要是通過從植物中提取的方式，目前相關技術比較成熟，因此，菊糖的價格便宜。

(2)左聚糖(levan)型果聚糖：主要以β-(2,6)鍵連接，這一類型的果聚糖主要存在于細菌和單子葉植物中；但不像菊糖，levan目前合成研究比較少，市場上沒有相關levan純品，可能與levan合成過程復雜性有關。

菊糖的一條代謝途徑如下所示，即廉價底物菊糖先通過菊糖果糖轉移酶(inulinfructotransferase，IFTase)被轉化成為附加值比較高的雙果糖酐(difructoseanhydride III，DFA-III)。雙果糖苷是一種新型的甜味劑和功能性食品添加劑，其相關研究是一個熱點。雙果糖酐在不被人體系統的消化酶分解，也不被人體腸道吸收，主要是通過腸道中微生物中的雙果糖酐水解酶水解成菊二糖(inulobiose)，菊二糖進一步被微生物中其它果糖苷酶水解成為果糖而被人體吸收利用。但是目前只有三篇有關雙果糖酐水解酶的報道，其中只有一篇報道利用的是純化出來的雙果糖酐水解酶，其它兩篇主要利用的是微生物全細胞而并沒有分離純化出雙果糖酐水解酶。因此，目前，對于雙果糖酐水解酶的研究處于萌芽階段。

在菊糖的這條代謝途徑中，菊糖是一種重要的膳食纖維，具有多種益生功能，在醫療上主要是用于腎小球過濾功能檢測用試劑；雙果糖酐的具有促進鈣離子吸收和骨骼生長等多種益生功能；果糖在人體代謝中發揮了重要的作用，是能量的直接來源。但是目前對于菊二糖的生理功能未有相關報道，甚至是對其理化性質也很少有研究。但是鑒于這條代謝途徑中其它糖的重要生理功能，菊二糖應該也是一種重要的糖。但是，目前市場上未有菊二糖的純樣品。對其合成的報道也是極少，其合成的研究可能是限制了菊二糖的大量生產和相關性質研究。

為了獲得更高效的生物催化劑，篩選新的并且可能具有高效率合成菊二糖的雙果糖酐水解酶是當前的關鍵任務。同時，通過定點突變的辦法，對來篩選到的雙果糖酐水解酶進行分子改造，從而進一步提高其催化活性以期得到更適合于工業應用的雙果糖酐水解酶。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種酶活提高的雙果糖酐水解酶突變體，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

編碼所述突變體C387A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。