[發明專利]陰溝腸桿菌blaNDM-1基因敲除的方法及應用

在審

• 申請號: 201810834010.3
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108949797A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 杜艷;堯靜;李婭;宋宇
• 申請（專利權）人: 昆明醫科大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種陰溝腸桿菌bla_NDM-1基因敲除的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一、陰溝腸桿菌質粒抗性改造

采用質粒小提取試劑盒對氨芐青霉素耐藥的陰溝腸桿菌質粒提取，通過PCR擴增四環素抗性基因片段，并采用DNA純化回收試劑盒純化回收四環素抗性基因片段的PCR產物，將純化的PCR產物進行酶切連接反應得到酶切連接產物，并將其轉化人大腸埃希菌DH5α感受態細胞后進行酶切鑒定重組質粒；

步驟二、Red重組系統依托質粒轉化入陰溝腸桿菌

采用超級感受態細胞制備試劑盒制備陰溝腸桿菌感受態細胞，將步驟一得到的重組質粒轉化入制備的陰溝腸桿菌感受態細胞，對細菌基因組DNA進行提取得到陽性克隆陰溝腸桿菌；

步驟三、同源重組片段的制備和純化

先通過PCR擴增同源重組片段，采用DNA純化回收試劑盒純化回收PCR產物，并進行DNA濃縮處理；

步驟四、陰溝腸桿菌電擊感受態細胞的制備及同源重組片段的電轉化

步驟五、PCR鑒定陰溝腸桿菌ΔNDM-1∷Kn重組子

步驟六、卡那霉素抗性基因的去除

制備陰溝腸桿菌ΔNDM-1∷Kn感受態細胞，將pCP20質粒轉化入陰溝腸桿菌ΔNDM-1∷Kn感受態細胞，過夜培養，隔天對單克隆菌落進行氯霉素和卡那霉素敏感檢測，對其敏感的菌落為bla_NDM-1基因敲除的陰溝腸桿菌。

2.如權利要求1所述的一種陰溝腸桿菌bla_NDM-1基因敲除的方法，其特征在于：所述步驟一酶切連接反應為：限制性內切酶對待改造質粒和PCR產物進行酶切；采用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切DNA片段并采用T4連接酶連接酶切片段得到酶切連接產物。

3.一種如權利要求1陰溝腸桿菌bla_NDM-1基因敲除的方法敲除bla_NDM-1基因的陰溝腸桿菌的驗證方法，包括：采用RNA試劑盒提取RNA；通過反轉錄系統對RNA進行反轉錄聚合酶鏈反應；之后對bla_NDM-1基因進行檢測。

4.一種陰溝腸桿菌bla_NDM-1基因敲除的應用，其特征在于：應用陰溝腸桿菌bla_NDM-1基因敲除方法制備的敲除bla_NDM-1基因的陰溝腸桿菌在鑒定bla_NDM-1基因對菌株的耐藥性和體外競爭力和生長能力的影響。