[發明專利]陰溝腸桿菌blaNDM-1基因敲除的方法及應用

在審

• 申請號: 201810834010.3
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108949797A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 杜艷;堯靜;李婭;宋宇
• 申請（專利權）人: 昆明醫科大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開一種陰溝腸桿菌bla_NDM?1基因敲除的方法及應用，涉及基因工程技術領域。利用Red同源重組技術成功地將陰溝腸桿菌bla_NDM?1基因敲除，通過PCR和測序驗證bla_NDM?1基因被成功敲除僅保留了1個FRT位點，進一步通過基因表達量驗證陰溝腸桿菌的bla_NDM?1基因表達量為對照菌株的1.2倍，說明此技術可用于陰溝腸桿菌的基因敲除與整合，同時驗證了bla_NDM?1基因敲除前后菌株生長趨勢與生長速度無明顯差異，對體外競爭力和耐藥性有一定影響；為陰溝腸桿菌中其他基因功能的研究奠定基礎。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體的涉及一種陰溝腸桿菌 bla_NDM-1基因敲除的方法及應用。

背景技術

抗菌藥物的耐藥史可追溯到抗菌藥物的發現及使用，近幾年由于抗菌藥物的廣泛使用導致耐藥致病菌也迅速增加；碳青霉烯類抗生素因具有抗菌譜廣、抗菌作用強、耐酶且穩定等優點，臨床長期廣泛應用于治療產超廣譜β-內酰胺酶(Extended-spectrum-β -lactamases,ESBLs)及高產AmpC型β-內酰胺酶的革蘭陰性菌引起的嚴重感染，被譽為治療革蘭陰性菌感染的最后一道防線(the last-resortantibiotic)；但隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae，CRE) 開始出現并逐年不斷增加；bla_NDM-1基因大多位于大小不一的可接合性質粒上，某些質粒具有較強的轉移能力和廣泛的宿主適應范圍，能在腸桿菌科細菌、假單胞菌屬、氣單胞菌屬及霍亂弧菌屬等多種屬細菌中存在，并能通過接合方式在菌種內或菌種間傳播。正是這些因素導致NDM-1酶陽性菌株具有流行性廣、耐藥性強和易傳播性等特點，已成為嚴重影響全球的公共醫療安全問題之一。

金屬β-內酰胺酶(MBLs)是一類活性位點結合有金屬離子且必須依賴金屬離子(主要是Zn 2+)的存在而發揮催化活性的β-內酰胺酶，該酶的水解活性強但能被EDTA、2-巰基丙酸等絡合劑抑制，是腸桿菌科細菌對碳青酶烯類抗生素耐藥主要原因之一，該酶主要包括 IMP、VIM、GIM、SPM、SIM及新發現的NDM-1。NDM-1酶是由269 個氨基酸組成的單一晶體，蛋白分子量27.5KDa，等電點為6.9，與其他的MBLs氨基酸序列相似性較低，與最相似的VIM-1/VIM-2相比，也只有32.4％的一致性。NDM-1含有兩個鋅離子結合位點即Zn1、Zn2，鋅離子在底物識別過程中起著重要作用，所以將鋅離子定義為NDM-1 活性中心，此活性中心較大、開放、有柔性，具有靜電剖面、與底物結合或釋放時活性中心能重排等特點，導致NDM-1具有強耐藥性 [56-57]。作為MBLs家族的新成員，NDM-1酶無疑超過了其他幾種 MBLs，成為了近年來威脅最嚴重的MBLs。但目前國內外學者大多聚焦在NDM-1酶陽性菌株耐藥機制及轉播機制的研究，而對于bla_NDM-1基因是否對菌株的生長能力和競爭力等其他生物學特性有影響卻尚無定論。

Red同源重組技術是由Datsenko和Wanner等基于λ噬菌體Red 重組系統建立的新型基因敲除技術，它重組效率高、所需同源臂短、不需構建打靶質粒，省去了體外DNA酶切和連接等步驟，縮短了試驗時間，提高了試驗效率。但Red同源重組技術最初是用于大腸埃希菌的基因敲除和整合，目前已將其用于肺炎克雷伯菌、痢疾桿菌和沙門氏菌等細菌的基因敲除，但陰溝腸桿菌未見報道。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種陰溝腸桿菌 bla_NDM-1基因敲除的方法，用于敲除陰溝腸桿菌質粒上的bla_NDM-1的耐藥基因，從而驗證bla_NDM-1基因對陰溝腸桿菌的耐藥性、生長能力和體位競爭力的影響。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明是通過以下技術方案實現：