[發(fā)明專利]一種以菊糖為底物合成菊二糖的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810831858.0
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108949857B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 沐萬孟;江波;郁書懷;張濤;朱鶯鶯;程園園
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/12;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種以菊糖為底物合成菊二糖的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。AcDFA?IIIase作為一個雙果糖酐水解酶能夠催化其底物雙果糖酐為菊二糖，此催化反應的最適pH是6.5和最適溫度55℃。在這個條件下，AcDFA?IIIase也能夠催化菊糖，產(chǎn)物是雙果糖酐和菊二糖。說明AcDFA?IIIase具有連續(xù)催化菊糖的能力，即先轉(zhuǎn)化菊糖為雙果糖酐，然后雙果糖酐進一步被轉(zhuǎn)化為菊二糖。這種以廉價菊糖為底物合成菊二糖的方法為工業(yè)化生產(chǎn)菊二糖提供了極大的參考價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以菊糖為底物合成菊二糖的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

菊糖(inulin)，是果糖以β-2,1-糖苷鍵相連而成的直鏈多糖，在鏈的還原端有一個葡萄糖基，菊糖的分子式表示為GF_n。其中G表示還原端的葡萄糖基，F(xiàn)代表果糖分子，n代表果糖單位數(shù)。菊糖的聚合度是2～60，分子量在3500～5000Da之間。菊糖可以提高植物的耐旱能力，還可以起到液泡滲透緩沖劑和低溫保護劑的作用。這主要是由于植物菊糖主要分布在細胞液泡中，起到了調(diào)節(jié)滲透壓的作用。菊糖這種果聚糖像淀粉這樣的葡聚糖一樣具有儲能作用，廣泛的存在于一些菊科植物中，如菊苣，菊芋，大麗花和牛蒡中。這些植物分布在很多國家。通常，菊糖的獲取是從這些植物中提取獲得。目前，提取技術(shù)成熟，因此，菊糖的價格廉價。菊糖作為一種膳食纖維，是一種低甜度、低熱量糖，具有增值雙歧桿菌、降低血糖血脂、增強人體免疫能力等功能，已實現(xiàn)廣泛商業(yè)化應用。

近年來，菊糖被用來加工合成雙果糖酐III這種新型功能性糖已經(jīng)成為菊糖加工的新方向。雙果糖酐III有利于鈣、鎂、鐵、鎂、鋅、銅等礦物質(zhì)元素的吸收，促進骨骼的生長；能夠促進腸道有益微生物群的生長繁殖、利尿、改善便秘、預防結(jié)腸癌；增進黃銅類物質(zhì)的吸收，促進大豆黃素代謝過程，提高黃酮類物質(zhì)的生物價值以及抗齲齒等作用。因此，目前雙果糖酐III及其合成酶菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶是研究的熱點。

這條代謝路徑中的菊糖、雙果糖酐和果糖都是重要應用的功能性糖，因此，在路徑上的菊二糖理論上應該也具有重要的價值。但是目前菊二糖的理化性質(zhì)以及生理性質(zhì)都是未知的，主要可能是因為其合成受限，市場上也沒有菊二糖樣品可獲得。而有關(guān)酶法合成菊二糖的合成研究極少，只有三篇有關(guān)雙果糖酐水解酶合成菊二糖的報道，其中只有一篇報道利用的是純化出來的雙果糖酐水解酶，其他兩篇主要利用的是微生物全細胞而并沒有分離純化出雙果糖酐水解酶。因此，對雙果糖酐水解酶的研究可能是工業(yè)酶法獲得菊二糖的一個重要途徑。雙果糖酐水解酶需要以昂貴的雙果糖酐為底物，經(jīng)濟上不可行。如果能找到一種直接利用廉價的菊糖為底物合成菊二糖的方法，而過程中又不需要添加菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶先轉(zhuǎn)化菊糖，則能更適合于工業(yè)生產(chǎn)菊二糖。目前的三篇雙果糖酐水解酶報道中，缺陷在于沒有對雙果糖酐水解酶催化菊糖的能力做鑒定或鑒定結(jié)果是對應的雙果糖酐水解酶不能催化菊糖。因此，發(fā)現(xiàn)一種同時具有雙果糖酐水解酶和菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶活性的酶作為催化劑，以廉價的菊糖為底物合成菊二糖，對菊二糖的工業(yè)生產(chǎn)有著至關(guān)重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種以菊糖為底物合成菊二糖的方法，所述方法是以菊糖為底物，以一種雙果糖酐水解酶(AcDFA-IIIase)為催化劑，將底物與酶混合于緩沖液中，在45～60℃溫度條件下下反應12～24h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述雙果糖酐水解酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.2。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述雙果糖酐水解酶可以采用如下方法來制備：

將編碼雙果糖酐水解酶的基因連接到質(zhì)粒載體pET-22b(+)，限制性內(nèi)切位點采用的是Nde I和Xho I，將構(gòu)建的pET-22b(+)-AcDFA-IIIase轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑選平板陽性單克隆進行發(fā)酵培養(yǎng)；在發(fā)酵后，離心獲得菌體，重懸后超聲破碎，鎳離子親和層析純化和透析后得到AcDFA-IIIase。