[發(fā)明專利]一種編碼易錯(cuò)DNA聚合酶及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810831279.6
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108949719B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉承蕓;楊秀清
• 申請（專利權(quán)）人: 山西醫(yī)科大學(xué);山西大學(xué)
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/70
• 代理公司: 太原申立德知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種編碼易錯(cuò)DNA聚合酶及其制備方法。本發(fā)明易錯(cuò)DNA聚合酶的制備方法，包括以下步驟：(1)提取紅球菌基因組DNA，測序，比對，得到易錯(cuò)DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：1；(2)克隆SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；(3)將核苷酸片段和質(zhì)粒pET32a進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒；(4)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21中，獲得表達(dá)菌株；(5)利用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)菌株，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)16?20h，裂解菌體，純化，獲得重組易錯(cuò)DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明提高了易錯(cuò)DNA聚合酶表達(dá)和純化效率，以獲得穩(wěn)定、高活力的易錯(cuò)DNA聚合酶，提高易錯(cuò)效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種編碼易錯(cuò)DNA聚合酶及其制備方法。

背景技術(shù)

PCR是一種DNA片段體外復(fù)制技術(shù)，但常有一定的堿基錯(cuò)配發(fā)生，一般錯(cuò)配率為10^-6～10^-5。 堿基錯(cuò)配雖然降低了DNA序列復(fù)制的保真性，但對獲得新DNA序列提供了一種可利用的突破 口。易錯(cuò)PCR是通過改變PCR條件，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基錯(cuò)配率，從而獲得與原來不同的DNA 序列或基因。易錯(cuò)PCR作為一種簡便、有效地獲得DNA序列變異的技術(shù)，主要是針對特定的 基因，這在遺傳和基因改良研究中具有巨大的應(yīng)用前景。易錯(cuò)PCR技術(shù)是采用多種方法提高 DNA聚合酶的堿基錯(cuò)配率，并穩(wěn)定非互補(bǔ)堿基對。改變PCR反應(yīng)條件的方法主要有4種，一 是使用低保真度Taq酶、并加大Taq酶用量；二是調(diào)整反應(yīng)體系中4種dNTP的濃度，使之 非1∶1∶1∶1的平衡濃度關(guān)系；三是在反應(yīng)體系中加入一定量的Mn²⁺；四是增加反應(yīng)體系中 的Mg²⁺濃度。此外，降低起始模板濃度、增加每個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間、提高反應(yīng)體系pH值、增加循環(huán)次數(shù)等也都可以明顯提高誘變率。幾種方法可單獨(dú)使用，但更多的時(shí)候是綜合使用，以求最簡單、快捷的得到更多的突變子。

以上的易錯(cuò)PCR研究全部采用改變PCR反應(yīng)條件，來提高DNA聚合酶錯(cuò)誤率的方法進(jìn)行， 但易錯(cuò)PCR產(chǎn)量和變異水平偏低。較低的模板濃度以及引物與模板結(jié)合嚴(yán)格性的降低，使得 目標(biāo)片段的產(chǎn)量偏低由于堿基變異偏好、轉(zhuǎn)換高于顛換，造成變異譜較窄，篩庫得到有益基 因的概率降低。三是對模板的要求較高，最好是只含目的基因的DNA片段。另外，應(yīng)用易錯(cuò) PCR時(shí)一般都要針對具體基因進(jìn)行誘變條件的優(yōu)化，需要優(yōu)化的條件有多個(gè)，包括Mn²⁺濃度、 Mg²⁺濃度、4種dNTP濃度、TaqDNA聚合酶濃度、模板濃度、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等，這些條 件綜合起來優(yōu)化還比較費(fèi)力。為了解決這些問題，有人嘗試通過修飾DNA聚合酶來提高常規(guī) PCR錯(cuò)配率的研究。Benjamin和Connolly于2004年報(bào)道了一個(gè)PfuDNA聚合酶的變種在易錯(cuò)PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出極好的性能。Pfu DNA聚合酶有兩個(gè)螺旋構(gòu)成了聚合酶的指狀子域，這一 區(qū)域負(fù)責(zé)將堿基與模板鏈正確地互補(bǔ)配對。當(dāng)兩個(gè)螺旋之間的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生變異，與缺失 3'-5'核酸外切酶活性同時(shí)發(fā)生時(shí)，一個(gè)高保真野生型聚合酶就變?yōu)榱艘粋€(gè)低保真聚合酶。這 個(gè)PfuDNA聚合酶變種能夠在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)條件下用于誘變基因，并得到高頻率、幾乎沒有任 何傾向的變異。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決易錯(cuò)PCR時(shí)操作的繁瑣及條件的優(yōu)化，本發(fā)明提供一種編碼易錯(cuò)DNA聚合酶及 其制備方法。該方法可以得到高純度易錯(cuò)DNA聚合酶。

本發(fā)明是為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的而采取的技術(shù)方案為：

一種編碼易錯(cuò)DNA聚合酶，所述編碼易錯(cuò)DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示， 基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明易錯(cuò)DNA聚合酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)提取紅球菌基因組DNA，測序，比對，得到易錯(cuò)DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：1；