[發明專利]一種編碼易錯DNA聚合酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201810831279.6
• 申請日: 2018-07-26
• 公開（公告）號: CN108949719B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 劉承蕓;楊秀清
• 申請（專利權）人: 山西醫科大學;山西大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/70
• 代理公司: 太原申立德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

1.一種易錯DNA聚合酶，其特征在于，所述易錯DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示。

2.權利要求1所述的易錯DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取紅球菌基因組DNA，測序，比對，獲得易錯DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：2；

(2)克隆SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；

(3)將步驟(2)所得的核苷酸片段和質粒pET32a進行連接，構建重組質粒；

(4)將重組質粒轉化到大腸桿菌感受態細胞E.coli BL21中，獲得表達菌株；

(5)利用LB液體培養基培養表達菌株，37℃培養4.5h后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導16-20h，裂解菌體，純化，獲得重組易錯DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述步驟(1)中所述的提取紅球菌基因組DNA的方法為：采用市售的細菌基因組DNA提取試劑盒提取紅球菌R04總DNA；所述的比對方法為：經華大基因測序，注釋，通過blast比對得到易錯DNA聚合酶序列，該序列全長為3252bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，編碼1123個氨基酸，以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子。

3.根據權利要求2所述的易錯DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的表達菌株的具體獲得方法為：通過PCR進行易錯DNA聚合酶基因的擴增，擴增引物為SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4，PCR產物經過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外燈下切割含有目的條帶的膠塊，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，回收產物和pET32a質粒進行EcoRI和NotI雙酶切，電泳，回收，將目的片段易錯DNA聚合酶基因和pET32a進行連接，16℃過夜，構建好的重組質粒命名為pET32a-error Taq，將重組質粒轉化入感受態E.coli BL 21中，獲得表達菌株。

4.根據權利要求2所述的易錯DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述裂解菌體是采用溶菌酶裂解。

5.根據權利要求2所述的易錯DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述純化是由熱變性沉淀和層析柱分離純化兩步組成。

6.根據權利要求4所述的易錯DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述溶菌酶裂解時采用的溶菌酶濃度為0.2-0.4mg/mL。

7.根據權利要求5所述的易錯DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述層析柱為鎳柱親和層析。

8.根據權利要求5所述的易錯DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述熱變性為裂解菌體采用溶菌酶裂解后，上清液80℃加熱30分鐘；離心，所得上清液進行鎳柱親和層析。