[發明專利]一種分離和純化外泌體的方法

在審

• 申請號: 201810824629.6
• 申請日: 2018-07-25
• 公開（公告）號: CN108865978A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 李萍;趙卓;張紹峰;康偉;蘇加忱;李淑君;馬南;王紹成;呂志
• 申請（專利權）人: 遼寧潤基生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎

本發明屬于生物檢測技術領域，是一種分離和純化外泌體的方法。從樣品中分離獲得含雜蛋白的外泌體懸液，利用羥基磷灰石分離純化獲得純外泌體。本發明方法操作簡單便捷、成本低，可快速高效地獲得高純度的外泌體顆粒，便于外泌體的蛋白質分析、外泌體DNA/RNA的提取、外泌體電鏡分析、外泌體粒徑分析等下游實驗。具有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，是一種分離和純化外泌體的方法。

背景技術

外泌體(exosomes)是一種含有復雜的蛋白質、脂質和核酸等活性生物分子的具有質膜雙分子層結構的微囊泡，直徑約為30-150nm，其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。

外泌體目前被視為特異性分泌的膜泡，參與細胞間通訊，免疫抗原呈遞，神經遞質傳遞，脂類代謝及細胞信號轉導等過程，并與多種疾病的發生、發展、治療及預后密切相關。所以很多科研人員對外泌體的研究興趣也日益增長，無論是研究其功能還是了解如何將其用于微創診斷的開發。開發從細胞培養液或生物流體分離外泌體的有效的方法可以讓研究者更好地了解微囊泡的成分。超速離心作為傳統并有效的分離外泌體的方法，其復雜的操作流程，昂貴的儀器設備，限制了外泌體的下游研究。目前市場上也有一些外泌體提取試劑盒，多數采用多聚物沉淀，也有采用密度梯度離心的，然而，這樣提取的外泌體，都包含很多雜蛋白。因此，去除雜蛋白是目前提取外泌體需要迫切解決的問題。專利(一種分離和純化不同外泌體亞群的方法)中有闡述利用羥基磷灰石進行尺寸排阻色譜法進行分離，其經過不同濃度的磷酸鹽進行梯度洗脫從而得到不同的集分，獲取不同亞群的外泌體并對其進行分析，但其獲取不同亞群的外泌體重懸液含大量雜蛋白，并非為純凈的外泌體，僅為含外泌體的混合液，因此現急需一種獲得純凈的外泌體的方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有外泌體分離技術的缺陷和不足，提供一種分離和純化外泌體的方法。

為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

一種分離和純化外泌體的方法，從樣品中分離獲得含雜蛋白的外泌體懸液，利用羥基磷灰石分離純化獲得純外泌體。

進一步的說，將含雜蛋白的外泌體懸液加入裝有羥基磷灰石的純化柱中，混勻搖動孵育20-60min后，用含有磷酸二氫鈉的NaCl溶液洗滌1-3次；然后利用高濃度的磷酸二氫鈉溶液洗脫，得到的洗脫液即為純凈的的外泌體溶液。

所述洗滌液為含有磷酸二氫鈉的500mM NaCl溶液,其中磷酸二氫鈉濃度為10mM。

所述洗脫時高濃度的磷酸二氫鈉溶液濃度為10mM-200mM。

所述含雜蛋白的外泌體懸液與羥基磷灰石體積質量(ul/mg)比為5-7：1。

所述樣品為細胞培養液、人體外血清、血漿或尿液。

所述含雜蛋白的外泌體懸液從細胞培養液樣品中獲得時：細胞培養液在4℃，12000g離心15min，棄沉淀，留上清液過0.22μm濾膜，過濾后濾液經外泌體提取淀試劑沉淀，即得含雜蛋白的外泌體懸液；

從生物體液樣品中獲得時：尿液樣品在4℃，12000g離心15min，棄沉淀，留上清液過0.22μm濾膜，過濾后濾液經外泌體提取試劑沉淀，即得含雜蛋白的外泌體懸液；

從人體外血清、血漿樣品中獲得時，在4℃，3000g離心15min，棄沉淀，留上清液過0.22μm濾膜，過濾后濾液經外泌體提取試劑沉淀，即得含雜蛋白的外泌體懸液。

所述外泌體沉淀的重懸試劑為10mM的NaH₂PO₄。

再進一步的說基于羥基磷灰石分離和純化外泌體的方法，主要包括如下步驟：