[發明專利]柑橘顯性功能突變體的制備方法

有效

• 申請號: 201810822742.0
• 申請日: 2018-07-25
• 公開（公告）號: CN108949819B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 孔佑涵;李衛東;李先信;吳娟娟;苑平;張平
• 申請（專利權）人: 湖南省園藝研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/78
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

本發明公開了一種柑橘顯性功能突變體的制備方法，包括：步驟一、利用第一對引物對，以pCAMBIA1300載體為模板，擴增得到含有轉移DNA結構域的載體骨架，之后將第一強啟動子基因、報告基因和第二強啟動子基因連接入該載體骨架轉移DNA結構域的左右兩邊界之間，構建獲得轉移DNA結構域含有目標序列的目的載體；步驟二、通過農桿菌介導的轉化法將目標序列整合到柑橘幼苗基因組上，篩選得到陽性轉化子；步驟三、將陽性轉化子培養成植株之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘顯性功能突變體。本發明創制出當代即可利用的柑橘遺傳材料，解決了當前無法利用T?DNA插入方法快速創制出直接可以利用的柑橘突變體的問題。

技術領域

本發明屬于生物技術研發技術領域，涉及一種柑橘顯性功能突變體的制備方法。

背景技術

T-DNA序列插入植物基因組后，能破壞插入位點基因的轉錄。將有T-DNA序列插入的植株通過自交回交等方法能在其子代中獲得該基因T-DNA插入純合的株系，即能獲得到該基因功能缺失的突變體。利用獲得的T-DNA插入純合突變體與野生型等植物材料在不同生長條件下進行表型檢測，已成為發掘鑒定擬南芥、水稻等植物功能基因的重要手段。但，柑橘的童期長，從種子生長成實生植株結出果實一般需要至少5年以上，因此柑橘不容易通過自交回交等方法快速獲得相關基因插入純合的植物材料，這也是至今無法利用大規模構建柑橘T-DNA插入突變群體的方法來發掘鑒定柑橘農藝性狀功能基因的重要原因。

在T-DNA內的邊界處安裝組成型強啟動子能對插入位點附近基因的表達產生影響。當邊界處含強啟動子的T-DNA插入植物基因組中時，既可能干擾插入位點處基因的正常表達(RNAi)，產生該基因沉默的功能缺失性突變體，也可能導致插入位點附近處基因過量表達，產生基因過量表達的功能獲得性突變體。這些顯性的功能突變體無需進行自交雜交等純化過程，當代的株系即可與其他植物材料進行表型比較來發掘鑒定植物性狀功能基因，這比利用純合T-DNA插入基因敲除突變體來鑒定基因功能的方法至少可節約繁育該植物1代的時間。

發明內容

本發明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優點。

本發明還有一個目的是提供一種柑橘顯性功能突變體的制備方法。

為此，本發明提供的技術方案為：

一種柑橘顯性功能突變體的制備方法，包括如下步驟：

步驟一、利用如SEQ ID NO：1和2所示的第一對引物對，以pCAMBIA1300載體為為模板，擴增得到含有轉移DNA結構域的載體骨架(pCAMBIA1300質粒來自于湖南省園藝研究所實驗室；PCR的反應體系(30μL)：10×PCR緩沖液3μL，dNTPs(each 2.5mmol/L)1μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，Pyrobest DNA聚合酶(5U/μL)1μL，模板(0.2μg/L)1μL，無菌去離子水23μL；擴增條件：95℃5min；95℃20s，55℃20s，72℃6min，25個循環；72℃10min)，之后將第一強啟動子基因、報告基因和第二強啟動子基因均連接入該載體骨架的轉移DNA結構域的左右兩邊界之間，構建獲得轉移DNA結構域含有目標序列的目的載體，其中，第一強啟動子位于報告基因的上游，第二強啟動子位于報告基因的下游；

步驟二、通過農桿菌介導的轉化法將目標序列整合到柑橘幼苗基因組上，篩選以得到含有報告基因的陽性轉化子；

步驟三、將所述陽性轉化子培養形成完整植株，之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘顯性功能突變體。

優選的是，所述的柑橘顯性功能突變體的制備方法中，所述步驟一中，所述報告基因采用GUS基因；

利用如SEQ ID NO：3和4所示的第二對引物對，以pBI121載體為模板，擴增得到含有所述GUS基因的產物。