[發明專利]柑橘顯性功能突變體的制備方法

有效

• 申請號: 201810822742.0
• 申請日: 2018-07-25
• 公開（公告）號: CN108949819B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 孔佑涵;李衛東;李先信;吳娟娟;苑平;張平
• 申請（專利權）人: 湖南省園藝研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/78
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

1.一種柑橘顯性功能突變體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、利用如SEQ ID NO：1和2所示的第一對引物對，以pCAMBIA1300載體為模板，擴增得到含有轉移DNA結構域的載體骨架，之后將第一強啟動子基因、報告基因和第二強啟動子基因均連接入該載體骨架的轉移DNA結構域的左右兩邊界之間，構建獲得轉移DNA結構域含有目標序列的目的載體，其中，第一強啟動子位于報告基因的上游，第二強啟動子位于報告基因的下游，所述轉移DNA結構域的右邊界與第二強啟動子的距離為十幾個堿基對；

步驟二、通過農桿菌介導的轉化法將含有目標序列的轉移DNA結構域整合到柑橘幼苗基因組上，篩選以得到含有報告基因的陽性轉化子；

步驟三、將所述陽性轉化子培養成植株，之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘顯性功能突變體；

所述步驟一中，所述報告基因采用GUS基因；

利用如SEQ ID NO：3和4所示的第二對引物對，以pBI121載體為模板，擴增得到含有所述GUS基因的產物。

2.如權利要求1所述的柑橘顯性功能突變體的制備方法，其特征在于，所述步驟一中，所述第一強啟動子為NOSp啟動子；

利用如SEQ ID NO：5和6所示的第三對引物對，以pBI121載體為模板，擴增得到含有所述NOSp啟動子基因的產物。

3.如權利要求2所述的柑橘顯性功能突變體的制備方法，其特征在于，所述步驟一中，所述第二強啟動子為CaMV 35S啟動子；

利用如SEQ ID NO：7和8所示的第四對引物對，以pBI121載體為模板，擴增得到含有所述CaMV 35S啟動子基因的產物。

4.如權利要求3所述的柑橘顯性功能突變體的制備方法，其特征在于，所述步驟一中，構建含有轉移DNA結構域的所述目的載體的具體步驟包括：

1.1)利用限制性內切酶SalⅠ對含有轉移DNA結構域的所述載體骨架序列擴增產物進行酶切，然后使其發生自連接反應，獲得pVC質粒；

1.2)首先利用限制性內切酶HindⅢ和SalⅠ雙酶切載體元件NOSp啟動子基因的擴增產物，同時利用限制性內切酶HindⅢ和SalⅠ雙酶切pVC質粒，之后分別取雙酶切后的NOSp啟動子基因擴增產物和雙酶切后的pVC質粒產物進行連接，獲得pVC-NOSp質粒；

1.3)首先利用限制性內切酶XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切載體元件GUS基因的擴增產物，同時利用限制性內切酶SalⅠ和XbaⅠ雙酶切pVC-NOSp質粒，之后分別取雙酶切后的GUS基因擴增產物和雙酶切后的pVC-NOSp質粒產物進行連接，獲得pVC-NOSpGUSter載體質粒；

1.4)首先利用限制性內切酶SalⅠ和XbaⅠ雙酶切載體元件CaMV 35S基因的擴增產物，同時利用限制性內切酶SalⅠ和XbaⅠ雙酶切pVC-NOSpGUSter質粒，之后分別取雙酶切后的CaMV35S基因擴增產物和雙酶切后的pVC-NOSpGUSter質粒產物進行連接，獲得所述目的載體pVC-NOSpGUSter-35S載體質粒。

5.如權利要求1、3或4任一項所述的柑橘顯性功能突變體的制備方法，其特征在于，所述步驟二中，通過農桿菌介導的轉化法將目標序列整合到柑橘幼苗基因組上的具體方法包括：

2.1)首先將所述目的載體轉化入農桿菌感受態EHA105細胞中，獲得含有目的載體的農桿菌EHA105宿主細胞，然后培養含有目的載體的農桿菌EHA105宿主細胞，并制備農桿菌轉化液；

2.2)首先在無菌條件下，橫截切取柑橘幼苗植株的節間莖段，每個節間莖段莖粗為1mm-3mm、長度為1cm-2cm，然后將各節間莖段浸泡于裝有上述農桿菌轉化液的三角瓶中，再然后將三角瓶置于真空抽氣裝置中，室溫條件下維持真空抽氣裝置中氣壓為0.01～0.03MPa，保持10～20min，然后緩慢解除低氣壓狀態，以三角瓶內的農桿菌轉化液液面不出現晃動為宜，直至真空抽氣裝置內恢復到正常大氣壓；

2.3)在無菌條件下，將經過轉化處理后的節間莖段置于生芽培養基上培養至生長出再生芽；

2.4)剪取再生芽部分葉片，利用GUS染色方法鑒定得到所述陽性轉化子。