[發(fā)明專利]一種表達卵形瘧原蟲AMA1蛋白的病毒疫苗的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810820775.1
• 申請日: 2018-07-24
• 公開（公告）號: CN109022456B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程洋;董春升;石曉丹;玄英花
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/47
• 分類號: C12N15/47;C12N15/86;C12N5/10;A61K39/015;A61P33/06
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種表達卵形瘧原蟲AMA1蛋白的病毒疫苗的制備方法，屬于病毒學和基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將表達卵形瘧原蟲頂端膜蛋白?1的基因插入到水皰性口炎病毒VSV基因組載體中，構(gòu)建重組病毒載體骨架質(zhì)粒XN2?AMA1，用含T7RNA聚合酶的痘病毒感染乳倉鼠腎細胞(BHK?21)后，將質(zhì)粒XN2?AMA1及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)粒pN、pP、pL共轉(zhuǎn)染BHK?21細胞，在細胞內(nèi)實現(xiàn)重組病毒的拯救，包裝出表達AMA1的類病毒顆粒，形成重組病毒rVSV?AMA1即為本發(fā)明疫苗。本發(fā)明疫苗操作簡單、產(chǎn)生滴度高、免疫周期短、可誘導強烈的體液及細胞免疫應答，有可應用于臨床使用的巨大潛能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒學和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種表達卵形瘧原蟲AMA1蛋白的重組水泡性口炎病毒疫苗的制備方法。

背景技術(shù)

瘧疾是一種古老的人類疾病，至今為止仍是全球范圍內(nèi)最重要的傳染性疾病之一，在全世界90多個國家中流行，超過3到5億人感染瘧疾，每年都有150～270萬人感染，其中兒童是感染致死的主要人群。瘧疾是由瘧原蟲通過蚊蟲叮咬感染傳播的疾病，寄生于人體的瘧原蟲共有4種，即惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲。其中惡性瘧原蟲是引起感染最為嚴重的一種，卵形瘧原蟲與其他瘧原蟲相比引起的感染癥狀輕微，因此受到了相對較少的關(guān)注度。目前對瘧原蟲的治療和研究主要集中在惡性瘧和間日瘧，對于卵形瘧研究較少，但在近幾年的病例報告中顯示感染卵形瘧原蟲可能引起嚴重的并發(fā)癥例如急性呼吸窘迫綜合征和急性腎衰竭等嚴重疾病，這提示尋找一種預防和治療其感染的有效手段十分必要。

長久以來，疫苗一直被公認為預防病原體感染的最直接有效的手段，理想的疫苗應當具備以下條件：(1)用于人、畜的疫苗必須安全，無副作用；(2)穩(wěn)定性好，能夠誘導較強的體液及細胞免疫應答，產(chǎn)生較好及持久的保護性免疫；(3)免疫方法簡單，且免疫次數(shù)少；(4)生產(chǎn)成本低，節(jié)省原料、可大量制備。

目前針對瘧原蟲的疫苗主要分為兩大類：一類是基因工程亞單位疫苗，該疫苗是將保護性抗原基因表以其產(chǎn)物蛋白質(zhì)或多肽制備的疫苗，例如針惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白CSP疫苗 RTS，S及頂端膜蛋白-1(AMA1)和網(wǎng)織紅細胞結(jié)合蛋白RH5的亞單位疫苗，都表現(xiàn)出了一定的保護性效果。這些疫苗具有安全性高，純度高，穩(wěn)定性好得優(yōu)點，但是其免疫效果較差，一般需要合適的佐劑輔助；另一類是載體疫苗，是將抗原通過微生物載體遞送到體內(nèi)引起免疫反應。以黑猩猩復制缺陷性腺病毒載體ChAd63和痘病毒安卡拉MVA載體制備的瘧原蟲疫苗能夠有效的誘導特異性免疫應答，產(chǎn)生特異性保護效果，展現(xiàn)出了較好的應用前景。

以水皰性口炎病毒VSV為載體的疫苗同樣屬于病毒載體疫苗，水皰性口炎病毒VSV為彈狀病毒科的單股負鏈RNA病毒，VSV基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA(ssRNA)病毒，長約11kb，從3′端→5′端依次排列著N、NS、M、G、L 5個不重疊的基因，分別編碼核(N) 蛋白、磷酸(P)蛋白、基質(zhì)(M)蛋白、糖(G)蛋白、及RNA聚合酶(L)蛋白等5種不同的主要蛋白。通過反向遺傳操作系統(tǒng)將插入抗原的病毒基因組及結(jié)構(gòu)蛋白N、P、L整合為類病毒顆粒，形成重組的病毒載體疫苗，該疫苗特點是操作簡單，產(chǎn)生滴度高，免疫周期短，單次免疫即可產(chǎn)生有效保護，可誘導較強的特異性體液及細胞免疫應答。與亞單位疫苗相比具有更強的免疫原性，與腺病毒載體相比單次免疫即可誘導較強免疫反應，是一種應用前景更好的疫苗。

疫苗免疫效果的好壞不僅取決于免疫方式，更重要的因素在于抗原。作為候選疫苗的抗原應為瘧原蟲感染的關(guān)鍵分子，阻斷該抗原可有效抑制瘧原蟲感染。瘧疾的危害主要是蟲體反復入侵紅細胞進行增殖破壞所致，裂殖子是瘧原蟲入侵紅細胞的為一階段，阻斷裂殖子入侵可有效控制瘧疾發(fā)作。頂端膜蛋白-1(AMA1)瘧原蟲裂殖子表面的一種膜蛋白，在裂殖子在定向和啟動裂殖子頂端形成緊密結(jié)合的過程發(fā)揮關(guān)鍵作用，是瘧原蟲入侵紅細胞時期的重要蛋白，以AMA1為抗原的疫苗免疫動物可以有效抵御瘧原蟲的感染。

發(fā)明內(nèi)容