[發(fā)明專利]一種表達(dá)卵形瘧原蟲AMA1蛋白的病毒疫苗的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810820775.1
• 申請日: 2018-07-24
• 公開（公告）號: CN109022456B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程洋;董春升;石曉丹;玄英花
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/47
• 分類號: C12N15/47;C12N15/86;C12N5/10;A61K39/015;A61P33/06
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種制備卵形瘧原蟲疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）構(gòu)建pXN2-AMA1重組質(zhì)粒：將編碼Genbank登錄號SCP04661.1卵形瘧原蟲頂端膜蛋白-1AMA1的基因，通過Xho1和Nhe1酶切位點插入到水皰性口炎病毒基因組G和L限制性酶切位點之間，構(gòu)建重組VSV骨架質(zhì)粒pXN2-AMA1；

（2）培養(yǎng)乳倉鼠腎細(xì)胞BHK-21；

（3）待乳倉鼠腎細(xì)胞生長至80%~90%匯合率，用含T7RNA聚合酶的痘病毒感染BHK-21細(xì)胞；

（4）通過反向遺傳操作將重組的骨架質(zhì)粒pXN2-AMA1及表達(dá)水皰性口炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白N、P、L的質(zhì)粒pBS-N、pBS-P、pBS-L轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞；

（5）轉(zhuǎn)染后，當(dāng)細(xì)胞有50%以上病變產(chǎn)生，則收集細(xì)胞上清液，并過濾除去混合在上清中的痘病毒；

（6）將步驟（5）得到過濾后的上清液再次感染新鮮的BHK-21細(xì)胞；

（7）在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞是否有病變產(chǎn)生，當(dāng)細(xì)胞有大于50%病變即可收集上清，離心除去細(xì)胞碎片后，在-80℃保存，即得重組rVSV-AMA1疫苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備卵形瘧原蟲疫苗的方法，其特征在于，步驟（1）中所述構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)過去內(nèi)毒素處理。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種制備卵形瘧原蟲疫苗的方法，其特征在于，步驟（2）在10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種5×10⁶個乳倉鼠腎細(xì)胞，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求 1或2所述的一種制備卵形瘧原蟲疫苗的方法，其特征在于，步驟（3）待細(xì)胞生長至80%~90%匯合率，將BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉，將痘病毒用DMEM無血清培養(yǎng)基稀釋感染BHK-21細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種制備卵形瘧原蟲疫苗的方法，其特征在于，步驟（5）轉(zhuǎn)染48h后觀察BHK-21細(xì)胞病變情況，當(dāng)細(xì)胞有50%以上病變產(chǎn)生，則收集細(xì)胞上清液，并用0.22μm濾膜過濾以除去混合在上清中的痘病毒。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種制備卵形瘧原蟲疫苗的方法，其特征在于，步驟（6）將步驟（5）得到過濾后的上清液再次感染新鮮的BHK-21細(xì)胞，置于5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1~6任一所述的方法制備得到的疫苗。