[發明專利]一種基于DNA組裝的恒溫條件下同時檢測多種microRNA的探針和方法

有效

• 申請號: 201810819681.2
• 申請日: 2018-07-24
• 公開（公告）號: CN109055524B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 戴宗;陳俊;呂品田;鄒小勇
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11;C12Q1/6816
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;舒勝英

本發明公開了一種基于DNA組裝的恒溫條件下同時檢測多種microRNA的探針和方法；本發明探針包括3條探針組；3條探針組和目標microRNA能夠自組裝形成穩定的“工”字形結構；再結合限制性內切酶的高特異性和對單鏈DNA切割特性，實現具有非序列依賴性的核酸酶功能的DNA模塊，應用于恒溫條件下多種miRNA的同時熒光檢測。解決常規恒溫擴增方法體系復雜問題，為多種miRNA同時靈敏檢測提供新方法。本方法僅需添加限制性內切酶和設計簡單的探針在不需添加dNTPs條件下即可實現恒溫信號擴增檢測核酸，且具有良好精確性，重復性和穩定性，適宜發展為試劑盒并向市場推廣。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種基于DNA組裝的恒溫條件下多種microRNA同時熒光檢測方法。

背景技術

microRNA(miRNA)是一類對基因表達具有調控作用的非編碼小分子RNA，在動植物生長、發育、分化和生殖等過程中發揮重要作用。人類約30％的基因受miRNA調控，且miRNA的表達水平與人類重大疾病密切相關。對miRNA的定量檢測有助于深入理解其作用機制，對疾病的診斷與治療以及相關基因藥物的開發等具有重要意義。研究表明，一種miRNA表達水平通常與多種疾病相關。例如，miR-373在乳腺癌、前列腺癌、食道癌以及肝癌中表達增加。Let-7a在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌以及卵巢癌中表達降低。因此，對疾病的精確診斷不能僅通過一種miRNA的表達水平，而通常需要根據多種miRNA的表達水平進行綜合判斷。由于miRNA的序列短(18-24堿基)，在細胞或者體液內的表達水平非常低，易降解，同源miRNA之間僅相差1-2個堿基，對檢測方法的靈敏度和特異性要求極高。Northern印跡技術是當前分析miRNA的常用方法，但方法操作繁瑣、耗時長、靈敏度低，需大量樣品及分離富集步驟，對RNase污染非常敏感，分析結果誤差大。Microarray方法可實現高通量、多組分同時檢測miRNA，但方法的特異性和靈敏度較低，芯片制備困難，檢測成本高。反轉錄定量PCR(RT-qPCR)是檢測miRNA的金標方法，但由于miRNA序列短，需要先反轉錄成cDNA才能PCR擴增，方法操作復雜，耗時長，且需要精確的控溫儀器，花費高，難于多miRNAs同時檢測。

近年來發展的核酸恒溫擴增技術，其特點是反應過程始終維持在恒定溫度，通過添加不同的酶和引物來達到快速擴增目的。但大多數恒溫擴增方法依賴復雜的引物設計、聚合酶、切口酶和dNTPs的共同參與。復雜的擴增體系在一定程度上限制了方法的應用范圍。發展簡單高效恒溫擴增方法實現多種miRNA表達水平的同時檢測意義重大。

發明內容

通過設計三條探針組，并結合限制性內切酶的高特異性和對單鏈DNA切割特性，實現具有非序列依賴性的核酸酶功能的DNA模塊，應用于恒溫條件下多種miRNA的同時熒光檢測。解決常規恒溫擴增方法體系復雜問題，為多種miRNA同時靈敏檢測提供新方法。

本發明的目的之一在于提供一種檢測microRNA的探針組。

本發明的另一目的在于提供一種檢測同時檢測多種microRNA的方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種檢測microRNA的探針組，所述探針組包括Y-1n、Y-2n和熒光探針LP；探針Y-1n、Y-2n、LP和目標microRNA能夠自組裝形成穩定的“工”字形結構；

探針Y-1n中間的部分堿基與Y-2n中間的部分堿基反向互補配對，形成“工”字形中間部分的莖部序列；

探針Y-1n、Y-2n的另一部分堿基序列與目標microRNA的兩端序列分別反向互補配對，形成“工”字形一端的“一”字形頭部；

探針Y-1n、Y-2n中還存在能與熒光探針LP兩端序列分別發生反向互補配對的堿基序列，形成“工”字形另一端的“一”字形頭部；

熒光探針LP與目標microRNA不能配對結合；