[發明專利]一種基因工程細胞及體外高效擴增NK細胞的方法

在審

• 申請號: 201810818273.5
• 申請日: 2018-07-24
• 公開（公告）號: CN108823171A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 許先進;韓俊峰;雷菁;曾祺森;劉慧瑩
• 申請（專利權）人: 武漢賽云博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0783
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種基因工程細胞，其特征在于，所述基因工程細胞為IL-15-IL-18-4-1BBL-K562細胞，該基因工程細胞能跨膜穩定表達IL-15、IL-18和4-1BBL。

2.一種如權利要求1所述基因工程細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)分別構建重組IL-15表達轉座子、重組IL-18表達轉座子和重組4-1BBL表達轉座子；

(2)重組IL-15表達轉座子與轉座酶共轉染K562細胞，并培養轉染后的細胞，經細胞分選，獲得IL-15跨膜穩定表達的IL-15-K562細胞；

(3)重組IL-18表達轉座子與轉座酶共轉染IL-15-K562細胞，并培養轉染后的細胞，經細胞分選，獲得IL-15、IL-18跨膜穩定表達的IL-15-IL-18-K562細胞；

(4)4-1BBL表達轉座子與轉座酶共轉染IL-15-IL-18-K562細胞，并培養轉染后的細胞，經細胞分選，獲得IL-15、IL-18和4-1BBL跨膜穩定表達的IL-15-IL-18-4-1BBL-K562細胞。

3.根據權利要求2所述的一種基因工程細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中分別使用PiggyBac轉座子系統構建重組IL-15表達轉座子、重組IL-18表達轉座子和重組4-1BBL表達轉座子；具體方法是：分別PCR擴增IL-15、IL-18和4-1BBL基因，然后分別將擴增產物插入Piggybac睡美人表達載體的XbaI-BamHI位點，分別構建對應的重組IL-15表達轉座子、重組IL-18表達轉座子和重組4-1BBL表達轉座子，其中IL-15，IL18帶有CD8TM跨膜區。

4.根據權利要求3所述的一種基因工程細胞的制備方法，其特征在于，所述Piggybac睡美人表達載體中含有人自身的EF1α啟動子和選擇標記基因。

5.權利要求1所述的基因工程細胞的應用，其特征在于，所述基因工程細胞應用于體外擴增NK細胞。

6.一種基于權利要求1中所述基因工程細胞的體外高效擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)構建能跨膜穩定表達IL-15、IL-18和4-1BBL的基因工程細胞IL-15-IL-18-4-1BBL-K562細胞；

(2)絲裂霉素C處理步驟(1)獲得的IL-15-IL-18-4-1BBL-K562細胞后，用NK細胞擴增培養液洗滌細胞若干次后，用含有10％自體血漿的NK細胞擴增培養液重懸細胞，制作成細胞懸液備用；

(3)將步驟(2)中的滅活IL-15-IL-18-4-1BBL-K562細胞懸液與PBMC細胞混合，在NK細胞擴增培養液中共培育；

(4)根據細胞狀態及培養基顏色變化，2～3天進行半換液，以獲得足夠量的NK細胞。

7.根據權利要求6所述的一種體外高效擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述IL-15-IL-18-4-1BBL-K562細胞是通過以下步驟制備的：

(1)分別構建重組IL-15表達轉座子、重組IL-18表達轉座子和重組4-1BBL表達轉座子；

(2)重組IL-15表達轉座子與轉座酶共轉染K562細胞，并培養轉染后的細胞，經細胞分選，獲得IL-15跨膜穩定表達的IL-15-K562細胞；

(3)重組IL-18表達轉座子與轉座酶共轉染IL-15-K562細胞，并培養轉染后的細胞，經細胞分選，獲得IL-15、IL-18跨膜穩定表達的IL-15-IL-18-K562細胞；

(4)4-1BBL表達轉座子與轉座酶共轉染IL-15-IL-18-K562細胞，并培養轉染后的細胞，經細胞分選，獲得IL-15、IL-18和4-1BBL跨膜穩定表達的IL-15-IL-18-4-1BBL-K562細胞。