[發(fā)明專利]一種基因工程細(xì)胞及體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810818273.5
• 申請(qǐng)日: 2018-07-24
• 公開（公告）號(hào): CN108823171A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許先進(jìn);韓俊峰;雷菁;曾祺森;劉慧瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢賽云博生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N5/0783
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程細(xì)胞和利用該基因工程細(xì)胞進(jìn)行體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法。該基因工程細(xì)胞利用Piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建跨膜穩(wěn)定表達(dá)IL?15、IL?18和4?1BBL的K562工程化細(xì)胞，并采用細(xì)胞體外刺激技術(shù)，提供一種基于基因工程K562細(xì)胞擴(kuò)增激活NK細(xì)胞的方法。該基因工程細(xì)胞能同時(shí)跨膜高表達(dá)IL?15、IL?18和4?1BBL；本發(fā)明的NK細(xì)胞擴(kuò)增方法操作簡(jiǎn)單、成本低，擴(kuò)增的NK細(xì)胞具有純度高、數(shù)量大、殺傷活性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于NK細(xì)胞大規(guī)模制作，為NK細(xì)胞過繼性免疫治療應(yīng)用于臨床打下了良好的基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程細(xì)胞和利用該基因工程細(xì)胞進(jìn)行體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

最新版的《世界癌癥報(bào)告》對(duì)全球180多個(gè)國(guó)家的28種癌癥的總體情況和流行趨勢(shì)進(jìn)行了全面的描述和分析，報(bào)告預(yù)測(cè)全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，2012年全世界共新增1400萬(wàn)癌癥病例并有820萬(wàn)人死亡。其中，中國(guó)新增307萬(wàn)癌癥患者并造成約220萬(wàn)人死亡，分別占全球總量的21.9％和26.8％。其中，肺癌、胃癌、肝癌為發(fā)病率最高的癌癥，而乳腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌使女性健康受到威脅。

腫瘤免疫治療被國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為第四大腫瘤治療法，其中自體免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、NK細(xì)胞)治療技術(shù)屬國(guó)家衛(wèi)生部首批允許臨床應(yīng)用的第三類醫(yī)療技術(shù)。近年來(lái)，自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)免疫治療技術(shù)在世界范圍內(nèi)正在成為一種可靠的抗癌療法，適用于多種惡性腫瘤的臨床治療且副作用小，不損傷正常組織。

NK細(xì)胞是機(jī)體抵抗惡性腫瘤和病毒感染的重要免疫細(xì)胞，無(wú)需有抗體存在或者預(yù)先致敏便可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是腫瘤免疫治療的重要效應(yīng)細(xì)胞。NK細(xì)胞表達(dá)CD56但缺失CD3，通常用CD3-CD56+來(lái)標(biāo)志和定義NK細(xì)胞。NK細(xì)胞對(duì)于不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞都具有很強(qiáng)的殺傷作用，在腫瘤的免疫細(xì)胞治療方面有著良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。NK細(xì)胞在外周血中約占淋巴細(xì)胞的5％-10％，所占比例很少。如何獲得足夠數(shù)量的高殺傷性的NK細(xì)胞是NK細(xì)胞應(yīng)用于臨床的重要保證。外周血中分離出來(lái)的高純度的NK細(xì)胞數(shù)量有限且增殖能力弱，在體外不給予其它影響因素的情況下，NK細(xì)胞增殖的效率和殺傷功能低下。

目前，體外促進(jìn)NK細(xì)胞的方法有很多，有在培養(yǎng)體系中加入動(dòng)物血清進(jìn)行培養(yǎng)，也有研究者將K562細(xì)胞通過基因修飾后經(jīng)過輻照，然后作為飼養(yǎng)層細(xì)胞在體外刺激NK細(xì)胞的生長(zhǎng)。上述方法雖然能夠刺激NK細(xì)胞高效擴(kuò)增，但是動(dòng)物血清成分復(fù)雜，取材過程中有可能帶入支原體、病毒，對(duì)NK細(xì)胞培養(yǎng)造成不確定性以及不安全性。

因此，進(jìn)一步開發(fā)一種能高效擴(kuò)增且保證NK細(xì)胞增殖速度和腫瘤細(xì)胞殺傷效果的NK細(xì)胞方法十分必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種基因工程細(xì)胞及體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，該基因工程細(xì)胞能同時(shí)高表達(dá)IL-15、IL-18和4-1BBL；采用本發(fā)明的方法不僅可以高效地?cái)U(kuò)增人NK細(xì)胞，而且還可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷力。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先提出一種基因工程細(xì)胞，所述基因工程細(xì)胞為IL-15-IL-18-4-1BBL-K562細(xì)胞，該基因工程細(xì)胞能跨膜穩(wěn)定表達(dá)IL-15、IL-18和4-1BBL。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提出一種上述基因工程細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

(1)分別構(gòu)建重組IL-15表達(dá)轉(zhuǎn)座子、重組IL-18表達(dá)轉(zhuǎn)座子和重組4-1BBL表達(dá)轉(zhuǎn)座子；

(2)重組IL-15表達(dá)轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶共轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，并培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞分選，獲得IL-15跨膜穩(wěn)定表達(dá)的IL-15-K562細(xì)胞；