[發明專利]一種用于高核酸酵母選育的高通量篩選體系及應用

有效

• 申請號: 201810815659.0
• 申請日: 2018-07-16
• 公開（公告）號: CN108893417B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 鮑曉明;徐麗麗;曾杜文;邱晨曦;易勇;張繼祥;吳倩;杜顯雨
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學;山東圣琪生物有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/65;C12Q1/04;G01N21/64;C12R1/865
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 陳桂玲

一種用于高核酸釀酒酵母選育的高通量篩選體系，是由報告質粒YEp?Hyg B?yeGFP和含有YEp?Hyg B?yeGFP的宿主細胞構成；報告質粒YEp?Hyg B?yeGFP為環狀，從5’到3’依次由YEplac195質粒骨架、酵母增強型綠色熒光蛋白基因yeGFP表達盒、潮霉素B抗性基因表達盒組成；宿主細胞的出發菌株是經篩選確認核酸含量高于正常值的釀酒酵母工業菌株。本發明還公開了篩選體系在高核酸酵母工程菌選育中的應用。該篩選體系可彌補傳統的高核酸酵母育種無法直接反映RNA含量的缺陷，并可借助其在酵母中的不穩定性，通過連續傳代即可輕易消除，對高核酸酵母在食品行業中的應用具有重要意義。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，尤其涉及一種用于高核酸釀酒酵母選育的高通量篩選體系及應用。

背景技術

核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)不僅在細胞內執行生物學功能，而且也是重要的新食品原料、食品添加劑和醫藥中間體等。RNA及其降解物、或相應的衍生物是多種藥物的有效成分[王楠,蔡夏夏,李勇.外源核苷酸與免疫功能研究進展.食品科學,2016,37(5):278-282.]，對人與動物的保健功效、免疫力提高等方面具有積極作用。近年來，RNA經多酶促定向轉化制備的5’-肌苷酸(5’-IMP)和5’-鳥苷酸(5’-GMP)，被稱為呈味核苷酸二鈉，具有獨特的“鮮味”口感和富含營養的特性，已經成為新一代的強化營養保健型核苷酸類食品增味劑，具有很高的經濟價值。

核糖核酸是生命存在的物質基礎，幾乎所有的生物體都含有核糖核酸，但并不是所有的生物資源都可以用來大規模提取核糖核酸，存在核糖核酸含量低、資源有限或工業上無法制備等問題。利用如枯草芽孢桿菌等微生物直接發酵產RNA雖然具有工業化價值，但由于RNA是大分子物質，發酵液粘度高，目前從發酵液中提取RNA在技術上仍有很大難度，限制了其工業化生產[喬賓福.微生物產生核苷和核酸[J].工業微生物,1998,(28):22-27.]。而作為食品安全級(Generally Regarded As Safe，GRAS)微生物，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是公認最理想的RNA源，不僅其RNA含量相對較高，而且抽提后的菌體蛋白質仍具有很高的應用價值，便于綜合利用。目前，國外酵母核酸生產主要集中在巴西，國內一些啤酒生產廠家利用啤酒生產過程中產生的廢酵母提取RNA雖然可以變廢為寶，實現資源的循環再利用，但因為原料質量差，RNA含量較低，產品質量很不穩定，相對轉換率低，對后續生產加工影響大，因此國內的醫藥廠家只能高價從國外如巴西進口大量的高含量酵母RNA產品，市場處于供不應求的局面。因此，選育高核酸酵母是勢在必行，也是解決這一問題的根本。

目前，對于高核酸釀酒酵母的研究已是當今的研究熱點之一，中國專利申請CN101760437A公開了一種“高核酸面包酵母及其制備方法”，該方法通過控制擴大培養的培養時間等條件，制備得到了含有相當于面包酵母菌體重量的20重量％以上的核酸，其中RNA達到了9.5％以上。中國專利申請CN102559522B公開了一種“高核酸面包酵母及其制備方法”，該方法在面包酵母擴大培養過程中添加谷氨酰胺和天冬氨酸，制備了相對于面包酵母菌體的100重量％，含有20重量％以上的核酸，其中RNA大于12.0重量％；中國專利申請CN106635851A公開了一種“高核酸釀酒酵母菌的選育方法”，該方法通過初篩和復篩后，經培養基優化，再經過小試和中試發酵工藝優化進行擴大化培養，獲得RNA含量為14.6％-15.2％的高核酸釀酒酵母菌。這種傳統的育種方法雖然避免了轉基因問題，但RNA含量檢測操作繁瑣，誤差較大，很難實現規模化篩選。