[發明專利]一種用于高核酸酵母選育的高通量篩選體系及應用

有效

• 申請號: 201810815659.0
• 申請日: 2018-07-16
• 公開（公告）號: CN108893417B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 鮑曉明;徐麗麗;曾杜文;邱晨曦;易勇;張繼祥;吳倩;杜顯雨
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學;山東圣琪生物有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/65;C12Q1/04;G01N21/64;C12R1/865
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 陳桂玲

1.一種應用高通量篩選體系選育高核酸酵母工程菌的方法，步驟是：

（1）高通量篩選體系轉化釀酒酵母細胞；其中，所述高通量篩選體系是指以釀酒酵母和大腸桿菌間穿梭的附加體質粒YEplac195為骨架，從5’到3’依次連接酵母增強型綠色熒光蛋白基因yeGFP表達盒和篩選標記基因表達盒；其中，酵母增強型綠色熒光蛋白基因yeGFP表達盒自上游至下游依次由rDNA啟動子、內部核糖體進入位點IRES（Internal ribosomeentry site）序列、yeGFP基因表達框、poly(T)序列、rDNA終止子組成，rDNA啟動子序列如SEQ ID No:1所示，IRES序列如SEQ ID No:2所示，yeGFP基因表達框序列如SEQ ID No:3所示，poly(T)序列如SEQ ID No:4所示，rDNA終止子序列如SEQ ID No:5所示；篩選標記基因表達盒為潮霉素B抗性基因表達盒，由TEF1啟動子、潮霉素B（Hyg B）基因、TEF1終止子組成，TEF1啟動子序列如SEQ ID NO:6所示，潮霉素B（Hyg B）基因序列如SEQ ID NO:7所示，TEF1終止子序列如SEQ ID NO:8所示；

（2）采用紫外誘變、甲基磺酸乙酯（EMS）誘變或常壓室溫等離子體（Atmospheric andRoom Temperature Plasma，ARTP）誘變方法誘變步驟（1）中所述含有高通量篩選體系的宿主細胞；

（3）采用流式細胞儀高通量規模化分選出熒光強度提高的酵母細胞；

（4）采用高氯酸法提取或Trizol法提取方式測定熒光強度提高的菌株細胞核酸的含量；

（5）采用在無篩選壓力的YPD液體培養基中連續培養、轉接10次以上的方式使選育出的高核酸酵母工程菌中含有的高通量篩選體系消除，獲得不含高通量篩選體系的非轉基因高核酸酵母工程菌。

2.根據權利要求1所述應用高通量篩選體系選育高核酸酵母工程菌的方法，其特征在于，步驟（1）所述高通量篩選體系轉化釀酒酵母細胞的方法是：1）利用PEG-LiAc轉化法、電轉化法或原生質體轉化法將高通量篩選體系轉化經篩選確認核酸含量高于正常值的釀酒酵母工業菌株；2）利用含有潮霉素B的篩選培養基篩選陽性轉化子，并從重組酵母中反提酵母質粒，PCR驗證，獲得含有高通量篩選體系的宿主細胞；其中所述核酸含量高于正常值的釀酒酵母工業菌株是酵母菌株CGMCC No. 9084。

3.根據權利要求1所述應用高通量篩選體系選育高核酸酵母工程菌的方法，其特征在于，步驟（1）所述高通量篩選體系的構建方法是：1）采用PCR的方法擴增潮霉素B抗性基因表達框，然后利用限制性內切酶酶切潮霉素B抗性基因表達框和YEplac195，連接液轉化大腸桿菌DH5α，挑選轉化子，利用PCR驗證，獲得重組質粒YEp-Hyg B；2）利用PCR的方法擴增rDNA啟動子、IRES序列、yeGFP基因、poly(T)和rDNA終止子，獲得融合PCR產物rDNAp-IRES-yeGFP-poly(T)-rDNAt，然后利用限制性內切酶酶切rDNAp-IRES-yeGFP-poly(T)-rDNAt和YEp-Hyg B，連接液轉化大腸桿菌DH5α，挑選轉化子，利用PCR方法驗證，獲得重組質粒YEp-Hyg B-yeGFP。