[發明專利]一種細胞因子誘導臍帶血自然殺傷細胞的高效擴增方法

在審

• 申請號: 201810815205.3
• 申請日: 2018-07-24
• 公開（公告）號: CN108893443A
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: 白利明;聶蘇秦;朱艷麗;張博;車小紅
• 申請（專利權）人: 陜西九州細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 吳甘棠

一種細胞因子誘導臍帶血自然殺傷細胞的高效擴增方法，包括以下步驟：一、試劑的準備；二、自體血漿的制備；三、單個核細胞的制備，淋巴細胞采用樣本密度分離液密度梯度離心法進行分離。四、自然殺傷細胞(Nature killer cell，NK)的擴增培養，采用細胞因子誘導法。本發明的NK細胞擴增方法在分離過程中加入了紅細胞沉降液，去除紅細胞干凈，臨床應用降低患者產生排異反應，擴增效率高，所得Nk細胞的純度高，且無需滋養層細胞，操作簡單，通用性好，所用試劑不含動物源成分，安全性好。

技術領域

本發明涉及一種自然殺傷細胞的擴增方法，具體涉及一種細胞因子誘導臍帶血自然殺傷細胞的高效擴增方法，屬于生物技術領域。

背景技術

自然殺傷細胞(Nature killer cell，NK)是除T、B細胞之外的第三類淋巴細胞，與T淋巴細胞不同，NK細胞無需預先接觸抗原刺激就即可殺傷靶細胞(如病毒感染的宿主細胞和腫瘤細胞)，由于NK細胞的殺傷活性無MHC限制，因此稱為自然殺傷活性。NK細胞作為人體天然免疫的重要組成部分，是機體抗御感染和防止細胞惡性轉化的重要免疫調節細胞，在免疫監視、免疫防御中起著十分重要的作用。2012年美國疾病控制中心報告NK細胞的活力和數量是人體健康的重要保證，幾乎所有疾病的發病都與NK細胞的活性明顯不足有關。隨著對NK細胞生物功能及活化機制的了解，利用NK細胞為靶點的免疫治療對疾病的早期預防、控制和治療具有重要意義。

近年來，免疫治療己經成為繼手術、放化療之后的第四大治療模式，并逐漸受到重視。過繼性細胞免疫治療法作為免疫治療方法的一種，在臨床研究方面取得了較大的進展。其中自體和異體外周血單核細胞(PBMC)來源NK細胞均被用于回輸，但自體來源NK細胞的臨床研究結果顯示其抗腫瘤效果非常有限。主要原因可能包括:

(1)自體NK細胞KIR與腫瘤細胞HLA相匹配，“自我”識別信號抑制NK細胞活化；NK細胞對腫瘤細胞的殺傷能力依賴于NK細胞表面活化受體和抑制性受體見得信號平衡；

(2)患者自體NK細胞在免疫抑制環境下發育異常，功能受損，難以通過體外誘導達到較好的殺傷能力。有學者研究發現異體NK細胞回輸具有較好的耐受性和安全性，并未引起嚴重的副作用和移植物抗宿主反應(GVHD)。另外異體NK細胞的供體選擇廣泛，細胞來源廣泛(包括外周血來源、臍血來源、胚胎干細胞來源等)。

因此相對自體來源NK細胞，健康異體來源NK細胞展示出更好的抗腫瘤效果，并成為近來臨床研究的主流。異體NK細胞回輸已被用于包括白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌等在內的多種腫瘤治療的臨床研究中。

但由于NK細胞的生產工藝不同，導致細胞成分和NK純度、活性差異顯著，其療效差異也較大。因此，NK細胞的體外生產工藝也是目前NK治療應用推廣的關鍵因素。

臍血作為異質性資源，來源豐富，無倫理問題，目前在NK細胞回輸免疫治療的研究中占了相當大的比例。但NK細胞在臍血細胞中所占比例較低，數量少，功能不成熟，需要經過體外分離及擴增培養，獲得大量高純度的NK細胞才能滿足臨床應用。因此，如何獲得高質量、高純度的NK細胞成為NK細胞臨床應用最為關鍵的問題之一。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種細胞因子誘導臍帶血自然殺傷細胞的高效擴增方法，以克服現有技術所存在的上述缺點和不足。

本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：

一種細胞因子誘導臍帶血自然殺傷細胞的高效擴增方法，包括：

一、試劑的準備；

1.基礎培養基

無血清培養基：GT-T551購自日本TaKaRa公司；

2.添加組分