[發明專利]一種細胞因子誘導臍帶血自然殺傷細胞的高效擴增方法

在審

• 申請號: 201810815205.3
• 申請日: 2018-07-24
• 公開（公告）號: CN108893443A
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: 白利明;聶蘇秦;朱艷麗;張博;車小紅
• 申請（專利權）人: 陜西九州細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 吳甘棠

1.一種細胞因子誘導臍帶血自然殺傷細胞的高效擴增方法，其特征在于，包括以下步驟：

一、試劑的準備；

二、自體血漿的制備；

三、單個核細胞的制備，淋巴細胞采用樣本密度分離液密度梯度離心法進行分離；

四、自然殺傷細胞(Nature killer cell，NK)的擴增培養，采用細胞因子誘導法。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：一、試劑的準備，包括以下步驟：

1.基礎培養基

無血清培養基：GT-T551購自日本TaKaRa公司；

2.添加組分

在所述基礎培養液，即無血清培養基中加入1％-10％的自體血漿，200-1000IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15和10-50ng/ml IL-21，IL-2、IL-15、IL-21、IL-12購自Pepro Tech公司；

3.紅細胞沉降液：6％羥乙基淀粉(HES)；

4.樣本密度分離液購自天津市灝洋生物制品有限公司；

5.臺盼藍拒染試劑盒；

6.FITC標記CD3、CD8同型對照IgG2α，PE-CD16和PE-CD56抗體購自美國BD公司。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：二、自體血漿的制備，包括以下步驟：

1)在生物安全柜內，將血液分裝到50ml離心管中，每管血液大約30ml，離心2500rpm，10min；

所述血液為臍血或外周血；

2)離心后，將上層血漿置于新的50ml離心管中，56℃水浴滅活30min，3500rpm，離心5min；

3)上清液轉移到新的50ml離心管中，丟掉下層絮狀沉淀，自體血漿于-20℃冰箱放置15min，3500rpm，離心5min；

4)上清液轉移到新的50ml離心管中，棄掉下層絮狀沉淀，自體血漿于4℃冰箱保存，以備細胞培養中添加使用。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：三、單個核細胞的制備，淋巴細胞采用樣本密度分離液密度梯度離心法進行分離，具體步驟為：

1)用生理鹽水按照1:1的比例稀釋上述用于血漿分離后的下層血細胞，然后以5：1的體積比加入紅細胞沉降液，搖勻后靜置，待分層后吸取上層細胞液，分裝至50ml離心管中，2200rpm，10min，收集下層細胞；

2)將步驟1)得到的下層細胞用生理鹽水充分混懸；

3)將混懸液加入到樣本密度分離液中，離心2100rpm，20min；

4)離心后液面將分為4層，從底部分別為紅細胞、淋巴分離液層、白膜層和上清液層，吸棄上清液層，緩慢吸取白膜層細胞至新的50ml離心管中；

5)將白膜層細胞加生理鹽水混勻，2200rpm，8min；

6)離心后棄上清，用生理鹽水重懸細胞沉淀，2000rpm，8min；

7)重復1800rpm，8min離心步驟一次，棄上清得到單個核細胞(PBMC)；

8)用培養基重懸，細胞計數、活率及表型檢測。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：四、自然殺傷細胞(Nature killer cell，NK)的擴增培養，采用細胞因子誘導法，具體步驟為：

單個核細胞(PBMC)接種密度為1.0-2.0×10⁶cell/ml，在混合培養基中連續培養15-20天左右，培養條件為、37℃、5.0％CO²培養箱中培養，培養過程每2-3天進行一次補液；

所述混合培養基組成如下：在所述無血清培養基的基礎上添加1％-10％自體血漿，200-1000IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15、10-50ng/ml IL-21和10-50ng/ml IL-12；IL-2、IL-15、IL-21、IL-12購自Pepro Tech公司。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：還包括流式檢測NK細胞的純度的步驟：

1)取單細胞懸液，離心1200rpm，5miml；

2)用PBS重懸細胞沉淀，調節細胞濃度為1.0×10⁶cell/100ul；

3)加抗體CD56、CD3，輕輕吹打混勻，4℃避光孵育30min，同時設置同型對照；

4)加1mlPBS于流式檢測管中，1200rpm，5min，棄上清；

5)加100ulPBS,輕輕吹打混勻，上機檢測；

結果擴增培養的NK細胞純度達到80％-90％。