[發明專利]茶樹四重熒光SSR分子標記檢測方法

在審

• 申請號: 201810814644.2
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN108998551A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 劉振;楊陽;趙洋;楊培迪;成楊;寧靜
• 申請（專利權）人: 湖南省茶葉研究所（湖南省茶葉檢測中心）
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明公開了茶樹四重熒光SSR分子標記檢測方法，通過引物組合、降落PCR、毛細管熒光電泳等技術的組合，建立了一套茶樹四重SSR分子標記檢測方法，本方法不僅可以提高茶樹SSR分子標記研究效率和準確性，而且可以節約勞力。而目前的茶樹SSR分子標記檢測主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，存在分辨率低、誤差大、效率低等不足，本發明提供的四重SSR分子標記檢測方法，該方法一次可以完成4對SSR引物的檢測。同時，免去了引物退火溫度篩選、人工跑膠、人工讀帶等不足，不僅大大提高了工作效率，而且簡便、迅速、準確，方法穩定、重復性好，可進行茶樹品種鑒別、指紋圖譜構建、群體遺傳結構和遺傳分化等研究。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及茶樹四重熒光SSR分子標記檢測方法。

背景技術

隨著分子生物學技術的不斷發展，特別是DNA分子標記技術的出現、發展及應用，對植物種質資源的研究起到了極大的推動作用。分子標記指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。分子標記的優越性表現為：(1)直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測到，不受季節、環境限制，不存在表達與否等問題；(2)數量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；(3)多態性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創造；(4)表現為中性，不影響目標性狀的表達；(5)許多標記表現為共顯性的特點，能區別純合體和雜合體。由于以上特點使它在評價物種的遺傳多樣性上更為直接、可靠，極大地彌補了傳統遺傳標記如形態學標記、細胞學標記、生化標記的不足。分子標記已在茶樹的遺傳多樣性、親緣關系分析、分類學等方面的研究中得到了廣泛的應用。SSR是目前茶樹分子標記研究中應用最多的標記類型。而目前茶樹SSR分子標記主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，每次只能完成1個標記的檢測，因此操作復雜、效率低、靈敏度差。同時還要進行不同引物退火溫度的篩選，影響了試驗效率。

發明內容

本發明的目的是提供一種通用的茶樹四重熒光SSR分子標記檢測方法。

為了實現本發明目的，本發明提供茶樹四重熒光SSR分子標記檢測方法，所述四重熒光SSR分子標記檢測是在2個PCR反應體系中實現的，即體系I和體系II，其中各PCR反應體系中包含2組引物，每組引物對應于1個SSR位點，4組引物可實現對4個SSR位點的檢測；其中，同一PCR反應體系中的2組引物的目的片段之間不能有重疊區域。

對于體系I，包括5個引物，分別為：熒光標記引物①，引物1和引物2的帶尾正向引物，引物1和引物2的反向引物；其中引物1和引物2的帶尾正向引物分別是指在引物1和引物2正向引物序列的5’端加上與熒光標記引物①相同的序列，但是不加熒光標記物；

對于體系II，包括5個引物，分別為：熒光標記引物②，引物3和引物4的帶尾正向引物，引物3和引物4的反向引物；其中引物3和引物4的帶尾正向引物分別是指在引物3和引物4正向引物序列的5’端加上與熒光標記引物②相同的序列，但是不加熒光標記物。

其中，2個熒光標記引物所含有的熒光標記物不同。

優選地，本發明中2個熒光標記引物的序列相同。

在本發明的一個具體實施方式中，所述茶樹為湘波綠2號。

4組引物的序列見表1：

表1

所述PCR反應體系如下：