[發明專利]茶樹四重熒光SSR分子標記檢測方法在審
| 申請號： | 201810814644.2 | 申請日： | 2018-07-23 |
| 公開（公告）號： | CN108998551A | 公開（公告）日： | 2018-12-14 |
| 發明（設計）人： | 劉振;楊陽;趙洋;楊培迪;成楊;寧靜 | 申請（專利權）人： | 湖南省茶葉研究所（湖南省茶葉檢測中心） |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產權代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;黃爽 |
| 地址： | 410125 湖南省長沙市*** | 國省代碼： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 茶樹 檢測 熒光 聚丙烯酰胺凝膠電泳技術 群體遺傳結構 指紋圖譜構建 茶樹品種 工作效率 溫度篩選 效率低等 引物退火 引物組合 熒光電泳 降落PCR 分辨率 毛細管 鑒別 遺傳 分化 研究 節約 | ||
1.茶樹四重熒光SSR分子標記檢測方法，其特征在于，所述四重熒光SSR分子標記檢測是在2個PCR反應體系中實現的，即體系I和體系II，其中各PCR反應體系中包含2組引物，每組引物對應于1個SSR位點，4組引物可實現對4個SSR位點的檢測；其中，同一PCR反應體系中的2組引物的目的片段之間不能有重疊區域；
對于體系I，包括5個引物，分別為：熒光標記引物①，引物1和引物2的帶尾正向引物，引物1和引物2的反向引物；其中引物1和引物2的帶尾正向引物分別是指在引物1和引物2正向引物序列的5’端加上與熒光標記引物①相同的序列，但是不加熒光標記物；
對于體系II，包括5個引物，分別為：熒光標記引物②，引物3和引物4的帶尾正向引物，引物3和引物4的反向引物；其中引物3和引物4的帶尾正向引物分別是指在引物3和引物4正向引物序列的5’端加上與熒光標記引物②相同的序列，但是不加熒光標記物；
其中，2個熒光標記引物所含有的熒光標記物不同。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，2個熒光標記引物的序列相同。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述茶樹為湘波綠2號；
4組引物的序列見表1：
表1
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR反應體系如下：
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR反應程序如下：包括3個touchdown循環以及30個標準循環，起始變性溫度為94℃3分鐘；3個touchdown循環為94℃變性30秒，68℃退火50秒鐘，每執行一個循環后退火溫度降低2℃，72℃延伸50秒；30個標準循環為：94℃變性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸45秒；完成以上循環以后，在72℃保持10分鐘；最后將PCR產物冷卻至室溫或4℃保存。
6.根據權利要求3-5任一項所述的方法，其特征在于，PCR反應結束后，將2個PCR產物按等比例混合，通過熒光毛細管電泳進行基因分型。
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